Řešení problémů s růstem buněk

Nic není šílenějšího než buňky, které nechtějí růst, nebo buněčné kultury, které se nechtějí přichytit k podkladu. Zpomalený růst buněk a nevyrovnané chování buněčné kultury může zpožďovat projekty, frustrovat vědecké týmy a nechat vědce přemýšlet, co se pokazilo a jak by to mohli napravit.

Řešení těchto problémů není vždy jednoduché. Kultivace buněk je složitá a bývá časově náročné rozebrat celý proces, aby se problémy identifikovaly. Mezi nejběžnější problémy obecně patří abnormální růst buněk nebo nerovnoměrné či nekonzistentní připevnění buněk k podkladu. Mezi další problémy patří pomalé nebo náhlé změny v rychlosti růstu nebo nevysvětlitelné výsledky.

Takové problémy bývají většinou spojovány s technikou kultivace, inkubací a použitými médii. Prozkoumejme několik těchto kritických bodů a způsoby, jak můžete předcházet jejich účinkům pomocí správných postupů.

Zkontrolujte techniku

Když se s buněčnými kulturami něco pokazí, první věc, kterou je třeba prověřit, jsou vaše techniky manipulace. Například pasážování kultur může vést k jejich kontaminaci, což je běžný, ale také vážný problém. Nesprávné míchání a pipetování může také způsobit problémy:

Nerovnoměrné zacházení nebo nedostatečné promíchání buněčného inokula může způsobit tvorbu pěny nebo bublin, které mohou bránit růstu a připevnění buněk k podkladu, nebo zanechávat skvrny na nádobách. Médium nalévejte nebo pipetujte opatrně, abyste zajistili materiál bez bublin.

Statická elektřina může narušit připevnění buněk v plastových nádobách, zejména v částech s nízkou vlhkostí. Při manipulaci s plastovými nádobami se snažte netřít nádoby o obal. Otření vnějšku nádoby hadříkem nebo použití antistatického zařízení může také potlačit statickou elektřinu.

Nedostatečné buněčné inokulum může způsobit silnější růst po stranách nádoby. Totéž může způsobit použití příliš malého množství média při pasážování buněk.

Rychlost otáčení rollerů („roller bottles“) může způsobit silný růst nebo shlukování buněk. Nastavte počáteční rychlost otáčení mezi půl otáčkou za minutu a jednou otáčkou za minutu a podle potřeby ji upravte. Udržujte válce čisté, abyste zabránili uklouznutí nebo upadnutí.

Obvykle poznáte, že se něco pokazilo, jakmile vidíte nerovnoměrně nebo neobvykle přichycené buňky k podkladu nebo zvláštnosti v jejich růstu. Chcete-li tyto problémy nejlépe odhalit, zafixujte zkoumané kultury pomocí glutaraldehydu nebo etanolu a před pozorováním je obarvěte.

Problémy s inkubací

I když by smyslem použití inkubátoru mělo být minimalizování vlivů prostředí, jako je například kolísání teploty, stále je zde mnoho faktorů, které mohou ovlivňovat rychlost růstu a životaschopnost kultury:

Změny teploty nastávají, když je inkubátor během experimentu opakovaně otevírán; kolísání teploty může také ovlivnit to, jak přesně a kde jsou nádoby s buňkami stohovány. Neotevírejte inkubátor, pokud to není nezbytně nutné, a uchovávejte kriticky důležité kultury v zadní části inkubátoru. Vezměte v úvahu také poziční účinky stohování nádob s kulturami; nejníže umístěné nádoby se nachází nejblíže kovové desce, takže se rychleji ohřívají.

Odpařování ovlivňuje rychlost buněčného růstu a jeho strukturu. Je možné ho minimalizovat udržováním vodních nádrží v inkubátoru plných a zvlhčováním přicházejících plynů pomocí plynové lahve.

Vibrace mohou způsobit neobvyklý růst buněk, například soustředné prstence buněk. Vibrace mohou mít původ v uvolněném motoru ventilátoru u inkubátoru nebo v jakémkoliv jiném zdroji, jako je například pěší ruch v okolí inkubátoru nebo různá motorizovaná zařízení v okolí. Inkubátory uchovávejte na pevných površích, na kterých se nenacházejí žádná další zařízení, která by mohla vibrovat.

Pro správný růst buněk jsou nezbytná i další opatření v rámci okolního prostředí, jako například udržování inkubátorů v rovině a bez toxických nečistot.

Možná je na vině médium

Nejrůznější problémy s médii nejsou vždy na první pohled viditelné. Na správnou funkci média může mít vliv mnoho faktorů, například nedostatečná kvalita reagencií, pufry a filtrace, a dokonce i toxicita fluorescenčního světla.

Kromě zajištění toho, že pro svůj výzkum používáte správné roztoky a nakupujete jen vysoce kvalitní spotřební materiál, je nejlepším způsobem, jak otestovat správnou funkci média, provedení experimentu. Porovnejte problémová média se stejnými médii od jiného výrobce. Pokud nové médium přinese stejný výsledek, může být problémová pravděpodobně technika nebo inkubace.

Přemýšlejte jako vědec

Pokud nejsou vaše techniky a zacházení s buňkami správné, mohou vaše živé buněčné kultury trpět. I když může být časově náročné izolovat jednotlivé kroky jeden po druhém, často to přináší nejlepší přehled o tom, co se přesně stalo a proč.

Přistupujte k abnormálnímu buněčnému růstu stejně jako k jakémukoliv jinému výzkumnému problému: Zaujměte hypotézu, testujte a analyzujte. Zanedlouho přijdete na to, jak udržet vaše vzácné buňky naživu – a váš výzkum na správné cestě.

(Převzato od společnosti Corning, redakčně upraveno.)