Endotoxiny jsou komplexní lipopolysacharidy, které plní důležité strukturní a funkční úlohy ve vnější membráně většiny gramnegativních bakterií. Jsou vylučovány v malém množství v době, kdy bakterie aktivně rostou, a ve velkém množství, když umírají. Všeobecně jsou známy pro své škodlivé účinky na růst buněk in vitro. Potenciálními zdroji endotoxinů v buněčné kultuře může být voda používaná k mytí skleněného nádobí a přípravě médií; média a séra z komerčních zdrojů; různé složky médií a jejich přísady; a laboratorní sklo a plasty. Dodržováním kroků, které zabrání problémům s buněčnými kulturami způsobenými endotoxiny, si vědci mohou být jistější svými experimentálními výsledky. Tento článek pojednává o osvědčených postupech vedoucích ke snížení rizika kontaminace endotoxiny.
1. Používejte ultračistou vodu
Laboratoře buněčných kultur se při přípravě médií a roztoků a také při mytí skla spoléhají na ultračistou vodu (high-purity). Špatně udržované systémy čištění vody, nádoby na skladování vody a navazující potrubí však mohou obsahovat značné množství bakterií produkujících endotoxiny a měly by být vždy testovány, pokud se objeví podezření na přítomnost endotoxinů nebo jsou v buněčných kulturách dokonce objeveny. Testování lze dosáhnout pomocí jednoduchého testu Limulus amebocyte lysate (LAL). Nyní jsou k dispozici citlivé formáty, které dokáží detekovat pouhých 0,001 endotoxinových jednotek/ml (EU/ml). Pokud se zjistí, že je zdrojem endotoxinů laboratorní voda a problém nelze vyřešit, lze k přípravě médií a základních roztoků použít nepyrogenní vodu pro injekce (WFI).
2. Zvažte výběr prémiového FBS
Vývoj testu LAL v 70. letech 20. století značně zvýšil povědomí o endotoxinech v sérech, přičemž studie provedená v té době ukázala, že ze 111 kontrolovaných šarží jich 23 % obsahovalo > 1 ng/ml endotoxinu [1]. Toto zjištění vedlo výrobce sér k tomu, aby manipulovali se surovinami za aseptičtějších podmínek, a mnozí nyní kromě standardních produktů FBS nabízejí také vysoce kvalitní FBS s nízkým obsahem endotoxinů (< 1 ng/ml). Ačkoli ne všechny buněčné kultury budou ovlivněny vyšším standardem, co se týče úrovně endotoxinů, prémiový FBS může být rozumnou volbou pro výzkumné pracovníky, kteří se obávají, že vyšší hladiny endotoxinů by mohly způsobit problémy s jejich specifickými buněčnými kulturami.
3. Zkontrolujte, zda média a přísady byly testovány na endotoxiny
Stejně jako standardní FBS má většina komerčně připravených médií certifikát, že obsahuje < 1 ng/ml endotoxinů. U mnoha kultur je tato úroveň vhodně nízká na to, aby se zabránilo nepříznivým účinkům na růst buněk in vitro, ale i přesto je důležité si uvědomit, že jakákoli činidla přidaná do média poté, co bylo filtrováno, mohou také obsahovat endotoxiny. Dříve zmíněná studie skutečně prokázala, že některé 1M roztoky aminokyselin obsahují hladiny endotoxinu v koncentracích až 50 ng/ml. Pokud je to tedy možné, měli by vědci požádat výrobce, aby potvrdili hladinu endotoxinů v jejich produktech. V případě jakýchkoliv pochybností by hladiny endotoxinů v médiích měly být testovány testem LAL před i po přidání nových složek.
Pokud je médium připravováno interně v rámci laboratoře, bude hladina endotoxinu určena především množstvím vody použité k rozpuštění složek média, takže je nezbytné provést rutinní testování zdroje vody pomocí testu LAL. Četnost tohoto testování bude do značné míry záviset na povaze prováděného výzkumu.
4. Dodržujte správné postupy autoklávování pro skleněné nádobí
Vzhledem k tomu, že mají endotoxiny vysokou tepelnou stabilitu, jsou standardní postupy laboratorního autoklávování při jejich odstraňování z laboratorního skla neúčinné. Ke zničení všech kontaminujících endotoxinů by laboratorní sklo mělo být vystaveno teplotě 250°C po dobu více než 30 minut nebo 180°C po dobu 3 hodin; to má další výhodu, a tou je sterilizace skleněného nádobí.
5. Používejte certifikované plastové výrobky
Ačkoli vysoké teploty používané při výrobě laboratorního plastu obvykle vylučují jakékoli kontaminující endotoxiny, ty sem mohou být následně znovu zavlečeny během manipulace s plastem, jako je například skládání a balení. Výběrem plastových výrobků, které jsou výrobcem certifikovány jako testované na endotoxiny a je u nich prokázáno, že je u nich obsah endotoxinů pod definovanou úrovní (obvykle < 0,1 EU/ml), si vědci mohou být jisti, že použité plasty nejsou zdrojem endotoxinů, které by mohly ovlivňovat růst jejich buněk.
Přestože není o mechanismech, kterými endotoxiny interagují s buněčnými kulturami in vitro, ještě známo zcela všechno, je zřejmé, že kontaminace endotoxiny zůstává hlavním zdrojem obav. Kdykoli jsou přítomny endotoxiny, vždy bude existovat určitá pochybnost o platnosti dosažených výsledků. I když jste si jisti, že endotoxiny nemají žádný vliv na vaše kultury, dodržování zde uvedených preventivních kroků vám může pomoci předcházet nechtěným překvapením.
(Převzato od společnosti Corning, redakčně upraveno.)
Reference
1. Case Gould MG. Endotoxin in Vertebrate Cell Culture: Its Measurement and Significance. In Uses and Standardization of Vertebrate Cell Lines. Tissue Culture Association, Gaithersburg, MD. 1984. pp. 125–136.