Práce s 3D buněčnými kulturami, zejména s organoidy, může být fascinující a poučná. Organoidy jsou důležitým nástrojem při modelování nemocí a objevování léků, protože lépe napodobují složení a funkčnost orgánů, čímž vznikají miniaturní in vitro verze in vivo materiálu.
Aplikace organoidů mají prakticky neomezený potenciál, jsou však mnohem složitější než 2D buněčné kultury nebo 3D sféroidy. Nenechte se ale touto složitostí odradit od toho, abyste se do této nově vznikající oblasti výzkumu ponořili. Zde uvádíme několik tipů, triků a osvědčených postupů týkajících se zmrazování, kultivace a měření organoidů, které vám pomohou vrhnout se do kultivace 3D buněk ihned.
Zamrazování organoidů
Správné zmrazení může znamenat rozdíl mezi buňkami, které vydrží po dlouhou dobu, a těmi, které ihned odumřou. Podle Nature Protocols se správná metodika řídí těmito 10 základními kroky:
1. Zchlaďte mrazicí nádobu (kontejner) na 4 °C. Pro každou kryovialku si předem připravte alespoň jednu nebo dvě konfluentní jamky podle toho, zda používáte 6-jamkové nebo 48-jamkové destičky.
2. Pipetujte bazální médium v množství 500 µl až 1 000 µl nahoru a dolů (jako při resuspendaci) pomocí 1 000 µl pipety, abyste rozbili základovou matrici, která obsahuje organoidy.
3. Přesuňte suspenzi s organoidy do 15 ml centrifugační zkumavky.
4. Přidejte k organoidům studené bazální médium a opakovaně jej resuspendujte, abyste odstranili základovou matrici.
5. Nastavte centrifugu na 100 až 200 × g při 8 °C. Centrifugujte po dobu pěti minut.
6. Odsajte všechen supernatant kromě asi 2 ml. Vyvarujte se rozbití organoidů na jednotlivé buňky.
7. Přidejte k organoidům další chladné bazální médium.
8. Nastavte centrifugu na 200 až 250 × g při 8 °C. Centrifugujte po dobu pěti minut.
9. Odsajte veškerý supernatant a resuspendujte jej v množství 500 µl studeného mrazicího média na jednu jamku nebo dvě jamky, podle toho, zda používáte 6-jamkové nebo 48-jamkové destičky.
10.Přeneste suspenzi do 500 µl kryovialek a umístěte je do mrazící nádoby. Nádobu ihned přeneste do teploty -80 °C; před následným přenesením organoidů do tekutého dusíku k dlouhodobému zmrazení zde ponechte mrazící nádobu alespoň 24 hodin.
Upozornění: Mrazicí médium obsahuje kryoprotektivum (CPA) jako je DMSO, které je pro buňky při pokojové teplotě toxické. Aby byly buňky při zmrazování zachovány životaschopné, je třeba se při jejich sklízení vyhnout nadměrnému působení CPA při pokojové teplotě.
Nemrazíte jednotlivé buňky – mrazíte organoidy, které se každým dnem zvětšují a stávají se složitějšími.
Velikost organoidů při zmrazení může mít velký vliv na jejich obnovu, když je nakonec rozmrazíte. Menší organoidy obvykle přežívají proces zmrazování a rozmrazování mnohem lépe.
Pokud jsou kultury pečlivě uchovávány, mohou vydržet dlouhou dobu – dokonce až deset let – což dává experimentům výhodu, co se týče dlouhodobé využitelnosti při získávání nových informací.
Existuje mnoho důvodů, proč by výzkumník mohl chtít skladovat své organoidy tak dlouho. Pokud například vytváříte knihovnu, můžete mít potenciální terapii, kterou chcete testovat na vzorku pacienta z doby před mnoha lety. Nebo to může být i tak, že navazujete na práci, kterou někdo jiný začal dělat jako doktorand, ale pak pokračoval jiným směrem.
Kultivace organoidů
Existuje více způsobů, jak vytvořit organoid – můžete jej vytvořit v kapkových kopulích, použít bioreaktory pro jejich zvětšení za účelem vysoce kapacitního (high throughput) použití, nebo z prostupných nosičů a mikrodestiček s nízkou adhezí. Způsob, který si vyberete, bude záviset na tom, co přesně chcete z experimentu zjistit.
– Matrixové kopule umisťují jednotlivé buňky nebo tkáně do samostatné kopule z extracelulární matrix, aby se mohl sestavit organoid. Výzkumní pracovníci mohou zvolit tuto metodu, pokud nemají k dispozici příliš velké množství organoidního materiálu nebo pokud se obávají, že snímání obrazů podle plochy bude trvat příliš dlouho.
– Bioreaktory uzavírají organoidy vyrobené z pluripotentních kmenových buněk do extracelulární matrice. Jsou ideální pro vysokokapacitní (high throughput) použití, kdy je potřeba vytvořit velké množství organoidů nebo je kultivovat po delší časové úseky.
– Propustné nosiče a mikrodestičky s nízkou adhezí mechanicky podporují organoid pomocí materiálů s rozhraním vzduch-kapalina nebo ultra nízkou adhezí, které zabraňují navázání buněk. Jsou ideální pro výzkumné pracovníky, kteří chtějí dále diferencovat buňky nebo provádět koncové testy. Předem potažené destičky mohou ušetřit ještě více času.
V závislosti na vašem postupu můžete vypěstovat organoid za pouhých šest dní. Doporučuje se však, abyste při sklízení pokud možno zachovávali stále podobné velikosti.
Když totiž rozbíjíte organoidy, rozbíjíte je na různě velké kousky. Čím více se vám je podaří udržet v konzistentní velikosti, tím více budete schopni zajistit, aby rostly stejnou rychlostí pro budoucí použití. Jedním ze způsobů, jak tuto variabilitu snížit, je nechat pomocí gravitace usadit těžší kousky organoidů na dno zkumavky, takže menší organoidy zůstanou nahoře. Tímto způsobem můžete shromáždit požadovanou populaci organoidů pro rovnoměrnější sklizeň.
Měření organoidů
Při měření organoidů jde opravdu o hodně, proto je nutné provést měření správně.
Velikost je jedním z několika faktorů, které se měří, aby bylo dobře stanoveno založení organoidu, takže je velmi důležitá. Kromě toho lze organoidy pěstovat in vitro pouze do omezené velikosti, a to kvůli absenci oběhového systému a omezení týkajícího se přenosu kyslíku a výživy.
Vzhledem k nepravidelnému tvaru organoidů a náročnosti jejich sterilního uchovávání je obtížné provádět měření ručně. Programy pro zpracování dat mohou výzkumníkům pomoci provádět přesná měření pod mikroskopem, aniž by je to stálo příliš velké množství peněz.
Pokud máte základní mikroskopickou kameru, můžete pořídit snímky organoidních kultur a zpracovat je pomocí bezplatného softwaru, jakým je například ImageJ. Takové služby však nejsou ideální pro velké objemy práce.
Pokud se místo toho snažíte provádět výzkum s vysokou kapacitou (high throughput), možná budete muset investovat do dražšího vybavení.
(Převzato od společnosti Corning, redakčně upraveno.)