Vzhledem ke klesajícím cenám služeb sekvenování nové generace (NGS) [1] a široké škále sad a nástrojů NGS, z nichž lze v dnešní době vybírat, se může zdát, že data NGS nebyla ještě nikdy dostupnější. Obdobně jako u většiny ostatních výzkumných pracovních postupů jde však o pouhou iluzi, že by bylo možno získat vysoce kvalitní data bez vysoce kvalitního výchozího materiálu.
V tomto článku vám představíme některé osvědčené tipy na hodnocení kvality vzorků a manipulaci s nimi před přípravou knihovny NGS, abychom vám pomohli NGS provádět úspěšně.
1. Posouzení kvality nukleových kyselin
Ať už používáte manuální nebo automatizovanou metodu extrakce nukleových kyselin, před dalším zpracováním byste měli vždy zkontrolovat čistotu a integritu každého vzorku nukleové kyseliny. Výchozím materiálem pro tvorbu knihovny NGS může být jakýkoliv typ dvouvláknové (ds)DNA nebo materiál, který lze na dsDNA konvertovat. Mezi běžné příklady patří genomová DNA (gDNA), produkty PCR a RNA.
Čistota vzorku
Po extrakci nukleové kyseliny lze čistotu vzorku posoudit pomocí spektrofotometrie. Relativní výskyt některých sloučenin, proteinů a organických rozpouštědel lze posoudit pomocí poměru A260/A280, který by se měl ideálně pohybovat mezi 1,8 až 2,0 u DNA a okolo 2,0 u RNA. Kontaminaci solemi, polysacharidy i některými organickými sloučeninami je možno posoudit pomocí poměru A260/A230, který by se měl pohybovat mezi 2,0 a 2,2 u DNA i RNA.
Integrita vzorku
Integritou máme na mysli neporušenost. Neporušená vysokomolekulární DNA (HMW DNA) by se měla v horní části agarózového gelu objevit jako ostře ohraničené pruhy a neporušená RNA jako dva výrazné pruhy ribozomální RNA. V závislosti na použité metodě izolace RNA můžete také vidět pruh s nízkou molekulární hmotností představující malou frakci RNA.
Přestože je starý dobrý agarózový gel mnohdy preferovaným způsobem vizualizace integrity vzorku, doporučujeme posouzení kontroly kvality doplnit jednou z mnoha dostupných kvantitativních metod. Pro současnou kvantifikaci a kontrolu kvality RNA doporučujeme Agilent BioAnalyzer. Pro přesnou kvantifikaci rozložení velikosti fragmentů HMW DNA doporučujeme buď Fragment Analyzer nebo FemtoPulse od společnosti Advanced Analytical.
Abyste minimalizovali degradaci nukleových kyselin a získali skutečný molekulární snímek vzorku (např. pro mikrobiomické studie), doporučujeme výchozí materiál (např. buňky apod.) uchovávat v komerčním stabilizačním činidle do té doby, dokud nepřistoupíte k samotné purifikaci nukleové kyseliny.
Dále doporučujeme, abyste nikdy nesekvenovali fragmenty DNA, které byly vizualizovány a vyříznuty z agarózového gelu, protože UV (a ethidium bromid) integritu DNA snižuje.
2. Přesná kvantifikace nukleových kyselin
Nováčkům ve světě NGS může připadat šokující, že při budování knihovny NGS dochází běžně při postupu od extrakce nukleové kyseliny až po výběr velikosti vzorku ke ztrátě 60–80 % vzorků. Proto je naprosto nezbytné vědět, kolik výchozího materiálu budete potřebovat, abyste v následujících krocích mohli pracovat se správným množstvím, a optimalizovat izolační protokoly tak, abyste dle potřeby dosáhli lepší výtěžnosti.
Níže představujeme doporučované metody pro přesnou kvantifikaci DNA a RNA pro účely NGS. Těmito metodami lze rovněž získat podrobnější kvantitativní informace o čistotě a množství nukleových kyselin.
Pro dsDNA: ke kvantifikaci dsDNA v rozmezí koncentrace 10 pg/µl až 100 ng/µl se doporučuje Qubit*.
RNA a HMW DNA (≥ 40 kb): jak už jsem uváděli výše, pro RNA se doporučuje Agilent BioAnalyzer, zatímco pro HMW DNA je vhodné používat Fragment Analyzer nebo FemtoPulse.
* Agilent BioAnalyzer a Advanced Analytical Fragment Analyzer jsou velmi užitečné také pro jinou než vysokomolekulární DNA.
3. Správná manipulace
Může se to zdát zcela samozřejmé, ale nikdy není od věci si připomenout, jak důležitá je v průběhu celého procesu správná manipulace se vzorky! Zde je několik jednoduchých tipů:
- Používejte rukavice a udržujte pracovní plochu v čistotě. Před prací s RNA otřete laboratorní stůl roztokem, který inaktivuje RNázy, buď komerčně dodávanými roztoky, nebo si můžete pomoci 0,5% roztokem dodecylsíranu sodného (SDS), po němž použijete ještě 3% H2O2.
- Se vzorky pracujte v nejvyšší možné míře na ledu a vždy s nimi nakládejte opatrně. Zamezte prudkému protřepávání, pipetování i vortexování, abyste minimalizovali fragmentaci nukleové kyseliny.
- Použití pipetovacích špiček se širokým otvorem vám umožní zachovat integritu HMW DNA a snadněji pipetovat viskózní roztoky, jako jsou právě roztoky obsahující vysokomolekulární DNA.
- Pro práci s RNA se doporučuje používat špičky s filtrem, čímž zamezíte potenciální kontaminaci RNA z pipety.
4. Ošetření a očištění od nukleáz
Přítomnost kontaminantů jako RNA či DNA, proteinů či chemikálií (jako jsou např. organická rozpouštědla, soli a polysacharidy) ve vzorcích DNA nebo RNA dokáže při přípravě knihovny NGS a následném sekvenování napáchat nezměrné škody. Proto se důrazně doporučuje ošetření vzorků DNA RNázou a vzorků RNA DNázou. Mějte na paměti, že samotné RNázy a DNázy mohou znemožnit vybudování knihovny NGS. Proto je zcela zásadní, abyste je před dalším zpracováním vzorků odstranili. Toho lze dosáhnout použitím řady komerčně dostupných čisticích sad.
Zpracováváte-li pro NGS jak DNA, tak RNA, velmi doporučujeme vyhradit si pro každou z nich samostatné pracovní místo, abyste zabránili případné křížové kontaminaci.
5. Uchovávání
Purifikované nukleové kyseliny je vhodné dlouhodobě uchovávat v Tris-EDTA pufru (konečná koncentrace 1x) v alikvotním množství při -80 °C, aby se zamezilo degradaci v důsledku opakovaného zmrazování a tání. Purifikované vzorky nukleových kyselin mohou být bezpečně uchovávány po dobu několika měsíců i při -20 °C, avšak před zahájením následného zpracování je vhodné zkontrolovat jejich integritu. Mějte na paměti, že dlouhodobější uchovávání purifikovaných nukleových kyselin ve vodě může vést k hydrolýze!
(Převzato od společnosti Nordic BioSite, redakčně upraveno.)
Zdroje:
- Wetterstrand KA. DNA Sequencing Costs: Data from the NHGRI Genome Sequencing Program (GSP) Dostupné na: www.genome.gov/sequencingcostsdata. [25.08.2021].