Příprava různých vzorků pro soupravy ELISA

Jak připravit vzorky plazmy a séra pro soupravy ELISA 

U plazmy:

1. Odeberte plnou krev do zkumavky s EDTA, citrátem nebo heparinem (např. BD vacutainer).
2. Centrifugujte 10 minut rychlostí 3 000 otáček za minutu.
3. Rozdělte do malých zkumavek a skladujte při teplotě -80 °C až do použití.

U séra:

1. Odeberte plnou krev do zkumavky bez aditiv (např. BD vacutainer).
2. Ponechte 20 minut při pokojové teplotě.
3. Centrifugujte 10 minut rychlostí 3 000 otáček za minutu.
4. Rozdělte do malých zkumavek a skladujte při teplotě -80 °C až do použití.

Poznámka: Bez ohledu na typ vzorku vám důrazně doporučujeme rozdělit po přípravě všechny vzorky na alikvoty, aby se minimalizovala degradace proteinů v důsledku několika cyklů zmrazení/rozmrazení. Tímto postupem bude rovněž zajištěna dostupnost vzorku pro další pokusy.

Příprava vzorků moči pro soupravy ELISA

1. Proveďte sběr moči bez přidání stabilizátorů.
2. Centrifugujte vzorky intenzivně (např. při 10 000 x g po dobu 1 minuty nebo při 5 000 x g po dobu 2 minut).
3. Rozdělte, rychle zmrazte v lázni suchý led/methanol a skladujte při -80 °C až do použití.

Poznámka: Bez ohledu na typ vašeho vzorku vám důrazně doporučujeme rozdělit po přípravě všechny vzorky na alikvoty, aby se minimalizovala degradace proteinů v důsledku několika cyklů zmrazení/rozmrazení. Tímto postupem bude rovněž zajištěna dostupnost vzorku pro další pokusy.

Příprava buněčných nebo tkáňových lyzátů pro soupravy ELISA

Buněčné nebo tkáňové lyzáty pro použití se soupravami RayBio® ELISA mohou být připraveny s pomocí nejběžnějších metod, např. homogenizace buněk nebo tkáně v lyzačním pufru RayBio®. Rovněž můžete použít vlastní lyzační pufr jako je např. RIPA nebo jiné přípravky pro imunoprecipitaci.

Vezměte prosím na vědomí následující pokyny týkající se složení lyzačního pufru:

1. Vyhýbejte se použití >0,1% SDS nebo jiných silně denaturačních detergentů. Obecně platí, že nejvhodnější jsou neiontové detergenty jako např. Triton X-100 nebo NP-40, ačkoli fungovat budou i zwitteriontové detergenty jako např. CHAPS, nebo jemné iontové detergenty jako např. deoxycholát sodný.
2. Používejte maximálně 2 % v/v celkového detergentu. 
3. Vyhněte se použití azidu sodného.
4. Vyhněte se použití redukčních činidel o koncentraci >10 mM (např. dithiothreitol nebo merkaptoethanoly).

Důrazně doporučujeme přidat koktejl inhibitorů proteáz do lyzačního pufru před homogenizací. Většina společností dodávajících běžné biochemické produkty včetně Roche, Sigma-Aldrich, Pierce a Calbiochem nabízí širokou škálu těchto produktů. Jelikož se náchylnost k proteolytickému štěpení a typ proteáz přítomných v lyzátu liší, nedoporučujeme žádný konkrétní produkt. Namísto toho by volba kombinace inhibitorů proteáz, které použijete, měla vycházet z rešerše literatury pro váš požadovaný protein (požadované proteiny) a/nebo typ tkáně nebo buněk. Lze použít inhibitory fosfatáz, avšak není to nezbytné, pokud protilátky použité v soupravě specificky nerozpoznají fosforylované formy proteinu.

Výběr metody lýzy a homogenizace zahrnuje rozdrcení pomocí skleněných kuliček, homogenizaci dle Dounce, zmrazení/rozmrazení, sonikaci a rozbití zmrazené tkáně pomocí třecí misky a tloučku, nebo dokonce kombinaci těchto metod. Neexistuje žádná nejlepší metoda pro všechny typy vzorků; metodu byste měli zvolit na základě rychlé rešerše literatury, abyste zjistili, jak byly vzorky podobné vašim vzorkům připraveny v předešlých výzkumech.

Po homogenizaci proveďte centrifugaci lyzátů za účelem odstranění zbytků buněk/tkáně (5 min @ 10 000 x g nebo 10 min @ 5 000 x g) a uchovejte supernatant. Pokud netestujete čerstvé lyzáty, měly by být lyzáty co nejdříve zmrazeny a uskladněny při teplotě -20 °C (nebo -80 °C, je-li to možné). Před použitím s jakýmkoli imunotestem proveďte znovu centrifugaci. Následně stanovte koncentraci proteinu v lyzátech pomocí testu pro stanovení celkového proteinu neinhibovaného detergenty (např. metodou BCA s kyselinou bicinchoninovou) a normalizujte objem každého použitého vzorku, aby v každém testu bylo stejné množství celkového proteinu.

Poznámka: Stanovení koncentrace proteinů metodou dle Bradfordové se nedoporučuje, protože může být inhibována přítomností detergentů.

Různé buňky a tkáně mohou obsahovat různé množství proteinů, proto doporučujeme jako výchozí bod použít 500 μl lyzačního pufru na 1×106 buněk nebo 10 mg tkáně. Je možné, že bude třeba provést úpravu na základě získaných výsledků. Cílová koncentrace celkového proteinu v homogenátu by měla být nejméně 1 000 µg/ml, avšak lepší by byla koncentrace 2 000 µg/ml nebo vyšší.

Poznámka: Bez ohledu na typ vzorku důrazně doporučujeme rozdělit po přípravě všechny vzorky na alikvoty, aby se minimalizovala degradace proteinů následkem několika cyklů zmrazení/rozmrazení. Tímto postupem bude rovněž zajištěna dostupnost vzorku pro další pokusy.

Jak připravit vzorky kondiciovaného média

Doporučujeme připravit vzorky média bez séra nebo s nízkým obsahem séra, protože sérum má tendenci obsahovat cytokiny, které mohou produkovat významné signály pozadí (background signals). Je-li nezbytné testovat médium obsahující sérum, doporučujeme také provést blank (slepý pokus) s nekultivovaným médiem k vyhodnocení výchozích (baseline) signálů. Hodnota výchozího (baseline) signálu může být poté odečtena od dat vzorku kultivovaného média.

• V 0. den nasaďte ~1 milion buněk do 100 mm kultivačních destiček s kompletním médiem.*
• 3. den odstraňte médium a nahraďte médium 6-8 ml média bez séra nebo s nízkým obsahem séra (např. médiem obsahujícím 0,2 % telecího séra).
• 5. den odeberte médium do 15 ml zkumavky. Centrifugujte při rychlosti 2 000 otáček za minutu v centrifuze při 4 °C po dobu 10 minut. Uchovejte supernatant. Převeďte supernatant do 1,5 ml zkumavek Eppendorf. Uchovejte supernatant při teplotě -80 °C až do pokusu. Většina vzorků může být takto uchovávána po dobu nejméně jednoho roku.

*Optimální počet nasazených buněk se liší u jednotlivých typů buněk a je možné, že bude třeba stanovit tento počet empiricky.

Poznámka: V případě, že je třeba provést další pokusy, důrazně doporučujeme rozdělit po přípravě všechny vzorky na alikvoty, aby se minimalizovala degradace cytokinů v důsledku několika cyklů zmrazení/rozmrazení.

(Převzato od společnosti RayBiotech, redakčně upraveno.)