Autor: Peter Jackson
Jedním z prvních, kdo zcela náhodou objevil možnost využití formalínu k fixaci vzorků tkání, byl lékař Ferdinand Blum na konci 19. století. Doktor Blum nebyl patolog, velice ho však zajímala bakteriologie. Když ho jistá chemická společnost požádala o posouzení antiseptických účinků nového komerčního výrobku (roztoku formalínu), ředěním 1 : 10 vytvořil 4% roztok, který měl podle jeho zjištění sice pomalu působící, avšak funkční dezinfekční účinky. Rovněž si všiml, že když mu po kratší dobu roztok ulpěl na prstech, kůže na prstech mu ztuhla. Pocit ztuhnutí byl obdobný jako u jiných fixativ, například u alkoholu. Na základě pozorování doktora Bluma se pak pro fixaci formalínem bez výhrad i nadále doporučovala 4% koncentrace, a to i přes jasně doložený nepříznivý vliv, který má fixace formalínem na imunoreaktivitu tkání.
Nicméně z hlediska dosažení konzistentního morfologického vzhledu tkáně zůstala fixace formalínem s následným zalitím do parafínu (FFPE) a barvením metodou Hematoxylin-Eosin pro patology celé minulé století první volbou. Patologové se učí, jak interpretovat řezy tkání fixované formalínem. Odklon od tohoto postupu pak může vést ke změnám morfologie tkáně a následně způsobit potíže při stanovení diagnózy. Nebýt rozvoje technik k odmaskování antigenů, potíže se sníženým imunologickým rozpoznáváním u tkání zpracovaných jako FFPE by zřejmě s rozšířením imunohistochemie v diagnostice vedly k volbě jiného fixativa.
Imunoreaktivita
Hlavním cílem imunohistochemiků je nastavit protokoly, jimiž lze dosáhnout co nejvyšší citlivosti, aniž by došlo k ovlivnění specificity. Na specificitu imunohistochemických metod má obrovský vliv kvalita primárních protilátek. Citlivost těchto metod je však nejvíce ovlivněna fixací tkáně.
Samotná fixace obvykle ke ztrátě imunologického rozpoznávání tkáňových antigenů nevede. Ztrátu rozpoznávání některých antigenů způsobuje specifická kombinace fixace, zpracování a zalévání tkáně do parafínu. Antigen, který lze při použití určitého fixativa prokázat na zmrazeném řezu, nemusí být při použití téhož fixativa prokazatelný po následném zpracování, zalití parafínem a přípravě parafínových řezů, přestože by byla u obou barvicích postupů použita tatáž protilátka.
Formalín denaturuje tkáňové makromolekuly, čímž zamezuje primárním protilátkám používaným v imunohistochemii v přístupu ke tkáňovým proteinům, které tvoří většinu tkáňových antigenů (tzv. maskování antigenů). Bylo prokázáno, že aldehydem vyvolané křížové vazby lze zrušit ošetřením vysokou teplotou nebo silně zásaditým činidlem. Shi a kol.[1] použili tyto techniky na tkáňové řezy a prokázali, že pokud řezy předem ošetří ponořením do roztoku těžkého kovu a zahřejí v mikrovlnné troubě, významně se tím zvýší citlivost imunohistochemických metod. Tuto techniku pojmenovali jako „odmaskování antigenu“ a od té doby byly obdobné účinky vykázány u řady dalších způsobů ohřevu, např. v tlakovém hrnci, autoklávu, napařovači či ve vodní lázni. Popisný pojem „teplem indukované odmaskování epitopů (HIER)“ je široce akceptován. Než byla metoda HIER objevena, nejpopulárnějším způsobem, jak zvrátit maskovací účinky fixace formalínem, bylo použití proteolytických enzymů (EIER) [2]. Volba proteázy, její koncentrace i čas trávení vycházejí převážně z empirických zkušeností. V každém případě je lepší optimalizovat použití jednoho zvoleného enzymu, nežli používat celou paletu enzymů.
Shrnutí
Základem kvalitního histologického preparátu je adekvátní fixace a kvalitní zpracování tkáně. V poslední době laboratoře čelí poptávce po kratších lhůtách dodávky vzorků k histologické diagnóze, což vede ke zkracování doby fixace vzorků ve formalínu.
Špatná či nedostatečná fixace vede ke špatnému zalití do parafínu a následně ke vzniku nekvalitních parafínových řezů. Řezy krájené ze špatně zpracovaných tkáňových bloků jen stěží odolají náročným odmaskovacím technikám a snadno ztrácí na kvalitě. Dochází ke zhoršení morfologie a ztrátě či difúzi antigenů.
Navzdory potížím, které se s fixací formalínem pojí, by se důležitost tohoto aspektu základní histologické techniky neměla nikdy opomíjet, má-li být dosaženo vysoce kvalitního imunobarvení.
Obrázky
Obrázek 1. Barvení estrogenových receptorů (ER) u karcinomu prsu. A. Ve tkáňovém bločku fixovaném po dobu tří hodin v 4% pufrovaném formolu se buňky pozitivní na ER zobrazují jen slabě. B. Ve tkáňovém bločku fixovaném po dobu osmi hodin v 4% pufrovaném formolu se buňky pozitivní na ER zobrazují silně.
Obrázek 2. Barvení leukocytárního antigenu LCA (CD45) na aktivní tonsile. A. Ve tkáňovém bloku fixovaném po dobu tří hodin v 4% pufrovaném formolu se lymfocyty zobrazují jen slabě. B. Ve tkáňovém bloku fixovaném po dobu osmi hodin v 4% pufrovaném formolu se lymfocyty zobrazují silně.
Klíčové faktory enzymatického trávení
Ke klíčovým faktorům enzymatického trávení patří:
- Teplota
- pH
- Koncentrace enzymu
- Doba trávení
Doba trávení je pro dosažení optimálního imunohistochemického barvení zcela zásadní a závisí na době trvání fixace ve formalínu. Tkáně, které byly ve formalínu fixované déle, je obvykle potřeba vystavit působení proteolytického enzymu po delší dobu. Může se stát, že se doba trávení bude lišit z důvodu různé enzymatické aktivity v jednotlivých šaržích. Dalším úskalím odmaskování antigenu pomocí enzymů je skutečnost, že u špatně zafixovaných tkání dochází snadno k nadměrnému natrávení, což má za následek ztrátu morfologických podrobností.
Není-li znám průběh fixace a zpracování pomocí parafínu, jako je tomu u konzultačních tkáňových bločků a řezů, může být k dosažení optimálních imunohistochemických výsledků nezbytné uplatnit různé doby trávení.
Klíčové faktory teplem indukovaného odmaskování
Metoda HIER (více o metodě na našem blogu) má řadu výhod i nevýhod. Hlavní výhodou je, že doba zahřívání k odmaskování antigenů je obvykle standardní bez ohledu na dobu fixace. Mezi další výhody patří:
- Zvýšená intenzita barvení
- Prokázání přítomnosti antigenů, jejichž přítomnost ve tkáni fixované formalínem běžně prokazatelná není
- Dosažení konzistentního, spolehlivého, vysoce kvalitního imunohistochemického barvení tkáňových antigenů citlivých na formalín
- Zvýšení poměru ředění primární protilátky
Standardizace základních postupů
Ke zkvalitnění laboratorních výstupů by měla významně přispět standardizace základních postupů používaných v histopatologii, jako jsou fixace, zpracování tkání a ošetření tkáňových řezů před imunobarvením. Postupy zpracování tkání však zdaleka standardizované nejsou. Složení použitého fixativa (tj. NBF, pufrovaný formol) nebo použití jiných roztoků formalínu (např. Bakerovy tekutiny) se tradičně ponechává na uvážení každé laboratoře. Totéž platí pro volbu reagencií a doby pro zpracování tkání. Vrcholným důsledkem této nedostatečné standardizace základních histologických procesů je vytváření unikátních preparátů – tkáňových bloků, které jsou jedinečné a charakteristické pro laboratoř, která jej vyrobila. Řezy nakrájené z takového bloku pro účely imunohistochemického vyšetření pak poskytnou vzorky, které mohou být značně odlišné od vzorků z řezů z materiálu fixovaného, zpracovaného a nakrájeného jinde. Při nakládání s takovým materiálem je podstatné, aby pracovníci laboratoře rozuměli problémům a úskalím spojeným se zmiňovaným materiálem a byli plně obeznámeni se zavedenými způsoby nakládání s protokoly, aby byli schopni dosáhnout vysoce kvalitního imunobarvení.
Úspěšnou imunohistochemii lze chápat jako správné spojení několika technických parametrů. Cílem imunohistochemie je dosáhnout reprodukovatelného a konzistentního prokazování antigenů s minimálně zabarveným pozadím při současném zachování integrity tkáňové architektury. Jedním ze základních aspektů je fixace a následné zpracování pomocí parafínu.
Adekvátní a vhodná fixace je základem všech histologických a imunohistochemických preparátů. Ideální fixace představuje dosažení rovnováhy mezi dobrou morfologií a dobrou antigenicitou. Špatná či opožděná fixace způsobuje ztrátu antigenicity nebo difúzi antigenů do okolních tkání. Špatně fixované bločky se nedaří odpovídajícím způsobem zpracovat v parafínu. Alkohol používaný při dehydratační fázi zpracování tkání je vynikajícím fixativem a taktéž výborným dehydratačním přípravkem. Má-li však být použit zároveň jako fixativum i dehydratační přípravek, jako například u špatně zafixovaných tkáňových bloků, nefunguje správně ani v jednom ohledu. Konečným produktem je pak blok, který je špatně zpracován, a proto nedostatečně prosycen parafínem. V případech, jako jsou tyto, však nemusí být vše ztraceno. Lze totiž provést opětovné zpracování a u většiny antigenů lze dosáhnout přiměřeného imunohistochemického barvení.
Profesní organizace College of American Pathologists se pokusila v USA řešit standardizaci fixace prsní tkáně (doporučení ASCO-CAP). Doporučují, aby byla tkáň fixována v NBF [3] minimálně šest hodin a maximálně 48 hodin. Stáří neutrálního pufrovaného formalínu nesmí přesáhnout jeden měsíc. Fixované tkáně, které nelze ihned zpracovat do parafínu, by měly být až do zpracování uchovávány v 70% alkoholu. Ve Spojeném království naopak dosud žádná oficiální doporučení týkající se typu fixativa nebo doby fixace neexistují. Studie provedená Goldsteinem a kol. 2003 [4] prokázala, že fixace biopsií prsu, jehlových biopsií a resekčních vzorků po dobu kratší než šest až osm hodin by mohla vést k falešně negativním imunohistochemickým výsledkům estrogenových receptorů. Proto se obecně považuje za nejlepší fixovat tkáně přes noc, spíše než spěšně zpracovat vzorek do parafínu v tentýž pracovní den. Množství použitého fixativa by mělo být v ideálním případě 15–20 násobkem množství fixované tkáně. Tkáně zvolené pro řezy by měly být dostatečně tenké, aby mohlo být dosaženo adekvátní fixace v přiměřeném čase. Množství tkáně určuje požadovaný objem fixativa, tloušťka vzorku pak určuje rychlost fixace.
Optimální ředění primární protilátky
Optimálním ředěním primární protilátky pro účely imunohistochemie je taková koncentrace primární protilátky, která poskytuje optimální specifické zabarvení s minimálně zabarveným pozadím. Optimální ředění závisí na typu a délce trvání fixace. Proto je nanejvýš důležité, aby si každá laboratoř nalezla ředění (titr) primární protilátky, které při použití preferovaného systému imunohistochemické detekce zajistí nejlepší výsledek. Z tohoto důvodu se stává jen velmi vzácně, že by různé laboratoře i při použití shodné imunohistochemické metodiky prokazování používaly i shodná ředění primárních protilátek.
(Převzato od společnosti Leica Biosystems, redakčně upraveno.)
Zdroje
- Shi SR, Key ME, Kalra KL. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin embedded tissue: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. J Histochem Cytochem 39:741-748 1991.
- Huang SN, Minassian H, More JD. Application of immunofluorescent staining on paraffin sections improved by trypsin digestion. Lab Invest 35:383-390 1976.
- Wolff AC, Hammond ME, Schwartz JN, Hagerty KL, Allred CD, Cote RJ et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. Clin Oncol. Jan 1;25(1):118-45. 2007.
- Goldstein NS, Ferkowicz MT, Odish E, Mani A, Hastah F. Minimum formalin fixation time for consistent estrogen receptor immunohistochemical staining of invasive breast carcinoma. Am J Clin Pathol 120:86-93 2003.