Enzymová imunosorbentní analýza, taktéž známá jako ELISA nebo EIA, je metoda určená k detekci a kvantifikaci rozličných látek, jako jsou peptidy, proteiny, protilátky a hormony. Identifikace látky je provedena pomocí specifických protilátek na základě barevné změny. Při testu ELISA je antigen zpravidla imobilizován na pevném povrchu a poté zkombinován s protilátkou, jež je označena enzymem. Detekce se provádí hodnocením aktivity konjugovaného enzymu (často HRP – křenové peroxidázy) inkubací s chromogenním substrátem za vzniku měřitelného produktu. Nejdůležitějším prvkem detekční strategie je vysoce specifická interakce protilátky s antigenem. Jedná se o běžný test, který se často používá k diagnostice některých chorob, jako je HIV – příčina onemočnění AIDS, lymská borelióza, perniciózní anémie, horečka Skalistých hor (Rocky Mountain spotted fever), rotavirový spinocelulární karcinom (rotavirus squamous cell carcinoma), syfilis a tak dále, detekcí příslušných protilátek v krvi pacienta.
V tomto článku se zaměřujeme především na běžné problémy ELISA experimentu:
1. Jaký je běžný postup ELISA testu?
2. Několik možných problémů barevné reakce v ELISA experimentu
● Nulový signál
● Nízká citlivost nebo slabý signál
● Vysoký signál na pozadí
● Pomalý vývoj barev
3. Další potenciální problémy ELISA experimentu
● Proč vypadá standardní křivka špatně?
● Proč jsou odečítaná čísla nízká, přestože se výsledky vizuálně jeví normálně?
● Proč je špatná opakovatelnost?
● Proč se vytváří neobvyklá barva?
1. Jaký je běžný postup ELISA testu?
ELISA se používá především k identifikaci přítomnosti specifických proteinů a ke stanovení jejich koncentrace. Existují čtyři typy testu ELISA – sendvičová, kompetitivní, nepřímá a přímá ELISA. Běžnými procedurami těchto testů jsou: skladování vzorků a reagencií, příprava reagencií, příprava ELISA destičky, přidávání vzorků nebo reagencií, inkubace, promývání a odečítání destičky. Jak je znázorněno na obrázku 1, ELISA test může být stručně rozdělen do pěti kroků.
Obrázek 1: Postup testu ELISA
2. Několik možných problémů barevné reakce v ELISA experimentu
Výsledky ELISA testu jsou obecně založeny na barevné změně chromogenního substrátu. Ve většině případů je potřeba, aby se barevná reakce prováděla při 37 °C po dobu asi 10 minut, poté se barevná reakce ukončí zastavovacím roztokem (Stop Solution) a absorbance je měřena čtečkou mikrodestiček při specifické vlnové délce. Protože je detekční dráha každé reakční jamky na čtečku mikrodestiček kolmá, měla by být při testování udržována čistota dna každé reakční jamky a množství chromogenního substrátu a zastavovacího roztoku by mělo být přesné. Nestejná množství kapaliny v jamkách a nečistoty (např. mastnota z rukou) na spodní straně destičky totiž negativně ovlivní přesnost výsledků. V této části shrnujeme několik možných nechtěných výsledků barevné reakce v ELISA experimentu. Kromě toho, jak ukazují tabulky níže, také naznačujeme možné příčiny a řešení problémů.
Tab. 1 – Nulový signál
| Příčina | Řešení |
| Nesprávně nastavená analýza, použita nesprávná reagencie nebo nesprávná vlnová délka.
|
Zkontrolujte protokol. Opakujte analýzu s použitím pozitivní kontroly a zkontrolujte nastavení čtečky destiček ohledně vlnové délky, filtrů, zesílení atd. |
| Použito nedostatečné množství protilátky. | Zkuste použít odlišnou koncentraci primární a/nebo sekundární protilátky. |
| Inkubační doba je příliš krátká. | Inkubujte vzorky přes noc ve 4 °C nebo následujte doporučení výrobce. |
| Protilátka byla skladována ve 4 °C již několik týdnů nebo byla opakovaně rozmražena a zamražena. | Použijte čerstvý alikvot protilátky, jež byla skladována při -20 °C nebo méně. |
| Rozpoznání epitopu bylo zabráněno kvůli adsorpci na destičku. | Abyste zlepšili detekci analytu přímým nebo nepřímým ELISA testem, konjugujte analyt před nanesením na mikrotitrační destičku s velkým bílkovinným nosičem. |
| Pomalý barevný vývoj enzymatické reakce.
|
Připravujte roztok substrátu bezprostředně před použitím. Zajistěte, aby zásobnímu roztoku nevypršela doba použitelnosti a nebyl kontaminován. Vyzkoušejte delší inkubaci. |
Tab. 2 – Nízká senzitivita nebo slabý signál
| Příčina | Řešení |
| Nesprávné skladování ELISA kitu.
|
Všechny reagencie skladujte podle doporučení. Pamatujte na to, že všechna činidla nemusí mít stejné požadavky na skladování. |
| Nesprávné nastavení čtečky destiček.
|
Zkontrolujte u čtečky destiček vlnovou délku, filtry, zesílení atd. |
| Inaktivní detekční činidlo nebo je detekční činidlo příliš zředěné. | Zajistěte, aby měl reportérový enzym očekávanou aktivitu, nebo použijte vyšší koncentraci detekčního činidla. |
| Na mikrotitrační destičku bylo naneseno nedostatečné množství antigenu. | Použijte pro potahování více antigenu nebo použijte potahovací pufr. |
| Nebylo použito dostatečné množství protilátky. | Zvyšte koncentraci primární a/nebo sekundární protilátky. Optimalizujte koncentrace protilátek pro svůj experiment. |
| Míchání nebo nahrazování reagencií z různých souprav. | Vyvarujte se míchání složek z různých souprav.
|
| Inkubační teplota je příliš nízká. | Optimalizujte inkubační teplotu pro svůj experiment. Před zahájením experimentu by činidla měla mít laboratorní teplotu. |
| Destičky pro stanovení byly nějakým způsobem porušeny nebo již dříve použity. | Nezapomínejte udržovat destičky v chladu a v uzavřených sáčcích společně s vysoušedlem, aby byla zachována jejich stabilita. Zabraňte tvorbě kondenzátu na destičkách tím, že je ještě v obalu necháte ekvilibrovat při pokojové teplotě. Pokud jsou použity destičky jen částečně, musíte si být jisti, že použité jamky označíte, abyste zabránili jejich opětovnému použití; zakryjte je těsnicí páskou a zbývající jamky použijte co nejdříve. Částečně použité destičky neskladujte s ostatními destičkami. Do odkládacího sáčku na destičky vložte vždy také vysoušedlo. |
Tab. 3 – Vysoký signál v pozadí
| Příčina | Řešení |
| Bylo použito příliš mnoho protilátky. | Optimalizujte koncentrace protilátek pro svůj experiment s různými ředěními. |
| Bylo použito příliš mnoho detekčního činidla. | Ujistěte se, že bylo činidlo správně naředěno, nebo opakujte experiment s vyšším ředěním detekčního činidla. |
| Inkubační teplota je příliš vysoká. | Vyzkoušejte jiné teploty pro optimalizaci testu. |
| Reakce není zastavena. | Použijte zastavovací roztok, abyste zabránili vyvolání příliš silného signálu. |
| Po přidání zastavovacího roztoku příliš dlouho čekáte na odečtení destičky. | Odečtěte destičku ihned po přidání zastavovacího roztoku. |
| Inkubace se substrátem byla prováděna na světle. | Provádějte inkubaci se substrátem ve tmě.
|
| Nespecifická vazba protilátky. | Použijte vhodný blokovací pufr nebo použijte afinitně čištěnou protilátku. |
| Špinavá destička. | Dno destičky opatrně očistěte a znovu destičku odečtěte. |
Tab. 4 – Pomalý vývoj barvy
| Příčina | Řešení |
| Inkubační teplota je nesprávná. | Zajistěte, aby destičky a reagencie byly udržovány při pokojové teplotě. |
| Kontaminované roztoky. | Použijte čerstvě připravené roztoky. |
| Detekční reagencie je příliš stará, kontaminovaná nebo byla použita při nesprávném pH. | Použijte čerstvá detekční činidla při správném pH. |
| Byl použit špatný konjugát, konjugát byl připraven nesprávně nebo se zhoršila jeho kvalita. | Ujistěte se, že použitý konjugát je ten, který byl dodán se sadou. Všechny konjugáty jsou specifické pro danou soupravu a danou šarži. Pokud je nutná příprava pracovního konjugátu, ujistěte se, že koncentrát a ředidlo jsou smíchány ve správných poměrech. Nepřipravujte pracovní roztok příliš dlouho dopředu a neukládejte žádnou nepoužitou část pro budoucí použití. Pokud není nutná žádná příprava konjugátu, odlijte pouze množství potřebné k okamžitému použití a nevracejte nevyužitou část do zásobní lahve. |
| Promývací pufr obsahuje azid sodný. | Vyvarujte se použití azidu sodného v promývacím pufru. |
3. Další potenciální problémy experimentu ELISA
V ELISA experimentu existuje kromě abnormální barevné reakce řada dalších problémů, zahrnujících standardní křivku, analýzu dat, opakovatelnost experimentu, atd. V této části uvádíme několik reprezentativních otázek.
Proč vypadá standardní křivka špatně?
V analýze dat z ELISA testu je standardní křivka nejdůležitějším faktorem pro testované vzorky. Proto jsou vytvoření dobré standardní křivky a kvalita standardu velmi kritické. Zde uvádíme několik důvodů a řešení týkajících se otázky „Proč vypadá standardní křivka špatně?“.
a) Standardní roztok je nesprávně připraven, měli byste se ujistit ohledně jeho ředění a připravit jej správně.
b) Standard je nesprávně rekonstituován. Před otevřením lahvičku krátce odstřeďte, aby se obsah usadil na dně, a po rekonstituci zkontrolujte, zda je všechen materiál rozpuštěný.
c) Standard je degradován, měli byste standard skladovat a zacházet s ním podle doporučení.
d) Křivka nepasuje do daného měřítka, zkuste ji vykreslit pomocí různých měřítek, např. log-log, 5 parametrová logistická křivka.
e) Chyba pipetování, zkontrolujte, zda byly použity kalibrované pipety a správná technika pipetování.
Proč jsou odečítaná čísla nízká, přestože se výsledky vizuálně jeví normálně?
Při odečítání destičky byl použit špatný filtr. Pro TMB (substrát křenové peroxidázy) a odečítání při vlnové délce 450 nm by měla být použita korekce vlnové délky 650 nm. Před čtením znovu zkontrolujte nastavenou vlnovou délku čtečky destiček, filtry, zesílení atd.
Proč je špatná opakovatelnost?
a) Nesprávné skladování soupravy nebo nevhodné skladovací prostředí. Všechny komponenty byste měli po co nejdelší dobu skladovat podle doporučení v datovém listu, nikoliv při pokojové teplotě.
b) Nesprávná příprava standardu. Standard byste měli rekonstituovat pouze doporučeným ředidlem a podle protokolu soupravy. Činidla byste měli připravit do 10 minut před použitím a poté je okamžitě přidat do jamek.
c) Nedostatečné promíchání po přidání vzorků. Při přidávání několika reagencií současně byste měli důkladně promíchat reagencie pomocí vortexu. Při držení reagencií v ruce buďte opatrní, aby nedošlo k jejich vystříknutí.
d) Špatná opakovatelnost měření z destičky. Měli byste kalibrovat čtečku destiček.
e) Nekonzistentní inkubační doba, podmínky promývání, podmínky vývoje barev a obsluha. Měli byste opakovat stanovení standardu. Zajistěte konzistentní podmínky reakce a obsluhy.
f) Nesprávné promytí. Měli byste přidat 200 μl promývacího pufru nebo zcela naplnit každou jamku pipetou, ale nesmí se stát, že tekutina přeteče do jiné jamky. Zkontrolujte, zda jsou všechny otvory promývacího přístroje destiček volné, abyste zajistili dostatečné promytí destičky.
g) Nerovnoměrná teplota. Během inkubace byste měli udržovat konstantní teplotu, abyste zabránili jejímu kolísání a nerovnoměrnému rozdělení.
h) Příliš mnoho zbytků na stěně jamek při přidávání tekutiny nebo dno jamek poškrábané špičkou pipety. Při přidávání tekutiny, které by mělo být pomalé a opatrné, byste měli špičku pipety umístit dostatečně nízko a do blízkosti stěny jamky. Nedotýkejte se dna jamek.
i) Opakovaně použité materiály. Měli byste měnit špičky u pipet mezi vzorky a zásobníky špiček mezi reagenciemi.
j) Příležitostné kladné a záporné hodnoty blízké hraniční hodnotě. Měli byste nastavit 3 duplikáty pro stejný vzorek a stejný výsledek u 2 vzorků.
k) Křížová kontaminace při přidávání vzorků. Při pipetování vzorků byste se měli vyvarovat křížové kontaminaci.
Proč se vytváří neobvyklá barva?
a) Křížová kontaminace během manuálního promývání. Křížovou kontaminaci byste měli snížit okamžitým odstraněním kapaliny z jamek po trojnásobném naplnění jamek promývacím pufrem pomocí ručního promytí a následně nastavením doby máčení pro příští experimenty.
b) Křížová kontaminace při vyklepávání destičky o papírovou utěrku. Pro vyklepávání destičky byste měli používat vhodné papírové utěrky. Do blízkosti destičky nevkládejte nesouvisející materiály. Nevyklepávejte destičky na stejném místě utěrky, abyste zabránili křížové kontaminaci.
c) Kontaminace v důsledku dlouhého skladování vzorků. Vzorky byste měli udržovat čerstvé nebo je skladovat při nízké teplotě, aby nedošlo ke kontaminaci.
d) Neobvykle vyvinutá barva kvůli nedostatečnému naplnění nebo příliš velkému zbytku tekutiny po promytí, pokud jsou ucpané trysky v promývacím přístroji destiček. Každou jamku byste měli plně naplnit tekutinou pomocí pipety, avšak nejsou povolena žádná přelití tekutiny do jiných jamek. Zkontrolujte, zda jsou všechny trysky v mycím přístroji destiček volné, abyste zajistili dostatečné umytí destiček.
e) Koagulace nebo interference sraženin nebo zbytkových buněk způsobená neúplnou centrifugací vzorků. Měli byste důkladně provést centrifugaci séra a plazmy.
f) Špatná příprava promývacího pufru nebo nesprávné použití koncentrovaného promývacího pufru. Připravte promývací pufr podle protokolu uvedeného v manuálu.
(Převzato od společnosti CUSABIO, redakčně upraveno.)