Rekombinantní proteiny ve výzkumu

Úvod

Proteiny hrají v lidském zdraví velmi významnou úlohu. Základní, aplikovaný a klinický výzkum se snaží porozumět tomu, jak exprese proteinů, jejich lokalizace, posttraslační modifikace (PTMs) a jejich interakce regulují homeostázu a nejrůznější choroby (Viz příklad níže). Naše současné porozumění tomu, jak proteiny ovlivňují buněčný fenotyp, je založeno na četných aplikacích jako je afinitní purifikace, western blotting a in vitro funkční analýzy. Mnohé z těchto technik využívají rekombinantní proteiny nebo proteiny exprimované v exogenních hostitelských systémech. V tomto článku budeme diskutovat o tom, 1.) jak se rekombinantní proteiny vyrábějí, 2.) jaké jsou výhody použití rekombinantních proteinů v proteomickém výzkumu, a 3.) jak mohou být rekombinantní proteiny použity v rozličných proteomických aplikacích.

Příklad mutovaného proteinu při onemocnění

Změny v přirozené expresi proteinu nebo v jeho funkci mohou přispět k rozvoji nemoci, k progresi nemoci, nebo k rezistenci vůči léčbě. Příkladem může být jeden z velmi často studovaných proteinů, tumor supresorový protein p53, jenž je nejčastěji mutovaným proteinem při výskytu rakoviny [1]. Po poškození DNA se p53 přesouvá do jádra, kde tvoří homotetramer. Ten se váže na DNA jakožto transkripční faktor a zprostředkovává zastavení buněčného cyklu (cell cycle arrest) nebo buněčnou smrt (apoptózu; Obrázek 1). Acetylace a fosforylace proteinu p53 ovlivňuje jeho aktivaci a schopnost vazby na DNA [2]. Některé mutace proteinu p53 účinkují dominantně negativním způsobem, kdy pouze jedna molekula naruší transkripční aktivitu celého p53 tetrameru [3]. Jiné mutace – jak „loss-of-function“, tak „gain-of-function“ mutace, tedy takové, kdy protein mutací buď svou původní funkci ztrácí, nebo naopak získává novou – mění oblasti DNA promotorů, na které se p53 tetramer váže [1]. Pokud je inhibována aktivace proapoptotických genů, mutace v proteinu p53 mohou vyústit až ke vzniku rakovinných buněk s dlouhou životností a přispívat k rezistenci vůči chemoterapii.

Obrázek 1: Tetramer proteinu p53 při vazbě na DNA.

Jak se rekombinantní proteiny vyrábějí

Prvním krokem k výrobě rekombinantního proteinu je syntéza příslušného genu. Je důležité promyslet sekvenci nukleových kyselin, neboť jedna aminokyselina může být kódována několika třípísmennými sekvencemi nukleových kyselin nazývanými kodony. Například čtyři kodony (CTT, CTC, CTA, CTG) budou přeloženy do aminokyseliny leucinu. Účinnost translace proteinu může být zvýšena pomocí optimalizace sekvence nukleových kyselin, jež bere v potaz tzv. codon bias vybraného expresního systému [4]. Ten vzniká z důvodu odlišné dostupnosti zásob tRNA nesoucích jednotlivé kodony.

Syntetizovaný gen je poté naklonován do expresního nebo virového vektoru [5,6]. Expresní vektor je cDNA plasmid, který obsahuje sekvenci promotoru a gen pro resistenci vůči antibiotiku. Je také časté, že vektor obsahuje na N- nebo C- konci sekvenci, která kóduje fúzní značku (tag) pro následnou purifikaci nebo identifikaci proteinu. Gen pro resistenci vůči antibiotiku umožňuje výběr buněk obsahujících plasmid pomocí kultivace v médiu s tímto antibiotikem. Ve virovém vektoru je gen pro požadovaný protein ohraničen virovými sekvencemi, což může nakonec vést k permanentnímu začlenění tohoto genu do hostitelského chromozomu.

Po naklonování jsou geny kódující příslušný gen vloženy do hostitelského systému, a to buď přechodně pomocí cDNA plasmidu (tedy pomocí tzv. transformace nebo transfekce), nebo stabilně pomocí virové infekce (tzv. transdukce) [5]. V každém případě musí plasmid kódující příslušný gen pasivně vstoupit do buňky skrze její membránu, jež byla dočasně oslabena („proděravěna“) pomocí kalcium fosfátu nebo elektroporace. K doručení DNA do buněk se používají také liposomy (Obrázek 2) [7]. Po transformaci (do bakterií) nebo transfekci (do savčích buněk) začnou buňky produkovat rekombinantní protein. Transdukce je oproti tomu několikastupňový proces. Nejdříve musí být buňka transfekována vyšším počtem plasmidů kódujících příslušný gen společně s různými virovými částicemi. Poté je příslušný gen zabalen do infekčního virionu pomocí exprimovaných virových částic. Nakonec jsou virové partikule posbírány a použity pro infekci expresního hostitelského systému.

Obrázek 2: Doručení cDNA plasmidu do expresního systému pomocí liposomů (endocytózou nebo exocytózou – fúzí s membránou).

Pro expresi rekombinantních proteinů jsou používány rozličné exogenní hostitelské systémy, jako je Escherichia coli, hmyzí buňky, kvasinky nebo lidské buňky. Escherichia coli (E. coli) je velmi atraktivním systémem, protože jsou jeho náklady nízké a čas, za který se bakterie zdvojí, je krátký (cca 30 min). To znamená, že rekombinantního proteinu může být za minimální náklady vyprodukováno mnoho (Tabulka 1) [6]. Je však nutno zmínit, že E.coli nemají stejné chaperonové proteiny jako lidské buňky, což znamená, že rekombinantní lidský protein se nemusí sbalit do správné konformace a nemusí si ponechat svou původní funkci. Nepřesně sbalené proteiny mohou jakožto exprimované proteiny „vypadávat“ z roztoku jako nerozpustné agregáty, jež vyžadují denaturaci pomocí denaturantů, jako je > 6 M močovina, aby se v roztoku staly opět rozpustnými. Aby protein zůstal nadále rozpustným, musí zůstat buď ve svém denaturovaném stavu, nebo může být „přeskládán“ ve vhodném pufru (jako je např. fyziologický roztok pufrovaný fosfáty). Je důležité zmínit, že „přeskládávání“ probíhá bez pomoci chaperonových proteinů, což zvyšuje nebezpečí, že protein nebude poskládán do své nativní struktury. E.coli mají také potíže s produkcí velkých proteinů (> 150 kDa) a nemají schopnost provádět posttranslační modifikace (PTM). Avšak ne všechny aplikace nutně vyžadují, aby měl protein svou přirozenou konformaci či aktivitu, což je diskutováno dále v tomto článku.

Buněčná linie HEK293, jež je odvozena z lidských embryonálních buněk ledvin, může být také využita jako exogenní hostitelský systém pro expresi rekombinantních proteinů, jedná se však o dražší expresní systém než je E. coli (Tabulka 1). Za zmínku stojí, že buňky HEK293 mají přirozené chaperony, které pomáhají skládat lidské proteiny a jsou schopné posttranslačních modifikací (PTM) [8]. Jako příklad můžeme uvést lidský protein nadvarlete 4 (HE4), jež je 13 kDa polypeptidem s velmi známým glykosylačním místem na asparaginu 44, který nejspíše napomáhá sekreci tohoto proteinu ven z buňky [9]. HE4 exprimovaný v E. coli (Obrázek 3A) se pohybuje v oblasti své předpokládané molekulární váhy, zatímco HE4 exprimovaný v lidských buňkách HEK293 (Obrázek 3B) má hmotnostní posun o cca 6 kDa, což je zapříčiněno glykosylací na asparaginu 44.

Tabulka 1: Srovnání expresních systémů z E.coli a savců. „Savčí“ systém znamená lidské buňky HEK293.

Obrázek 3: SDS-PAGE analýza purifikovaného proteinu HE4 exprimovaného v E.coli nebo lidských HEK293 buňkách. A) HE4 exprimovaný v E.coli s N-terminální 6x histidinovou a thioredoxinovou kotvou. Protein se pohybuje v oblasti cca 30 kDa, což je odhadovaná molekulová váha takto označeného HE4 proteinu. B) HE4 exprimovaný v lidských HEK293 buňkách s C-terminální 6x histidinovou kotvou. Protein se pohybuje ve své odhadované molekulové hmotnosti cca 14 kDa. Proužek ve velikosti cca 20 kDa představuje glykosylovanou formu proteinu HE4.

Co se týče účinnosti exprese, ani E. coli, ani lidské buňky HEK293 nejsou vítězi. Exprese proteinu se může v obou systémech pohybovat od nízké po vysokou a je nemožné předem určit její účinnost, neboť se liší protein od proteinu. Je taktéž těžké předpovídat, zdali bude protein exprimovaný v E. coli tvořit nerozpustné agregáty. Některé proteiny navíc nemohou být exprimovány ani v jednom systému, protože jsou pro buňku toxické [6].

Rekombinantní protein může být oddělen od ostatních proteinů v buněčném lyzátu pomocí imunoafinitní nebo afinitní purifikace. V případě imunoafinitní purifikace je použita protilátka, která se naváže a pomůže odseparovat specifický požadovaný protein. Avšak ne pro všechny cílené proteiny existuje odpovídající protilátka, která by byla zároveň kompatibilní s touto aplikací. Tento přístup je taktéž nepohodlný pro experimenty s vysokou výtěžností (tzv. high throughput experimenty), kde je potřeba purifikovat mnoho proteinů najednou, neboť pro každý protein je potřeba použít specifickou a spolehlivou protilátku. Proto je většina rekombinantních proteinů purifikována skrze jejich fúzní značky (kotvy). ¹¹ Imunoafinitní purifikace, jež cílí na fúzní značku, může být použita také, ale afinitní purifikace zaměřená na fúzní značku pomocí jedinečných charakteristik této značky je využívána mnohem častěji. Příkladem jsou proteiny značené histidinem, které jsou purifikované pomocí kolonky obsahující nikl. Proteiny se značkou z proteinu vázajícího maltózu (MBP) jsou purifikovány za použití amylózy. Proteiny označené značkou Flag jsou purifikovány pomocí protilátky proti této Flag značce. Histidin, protein vázající maltózu (MBP) a Flag značka jsou pouze některé z mnoha dostupných možností. Další výhodou využití fúzní značky je to, že exprimovaný protein může být ověřen pomocí western blottingu pomocí protilátky proti fúzní značce, které bývají většinou jednoduše dostupné. Jak imunoafinitní, tak afinitní purifikace většinou produkují proteiny o vysoké čistotě (> 95%), ačkoliv je důležité zmínit, že čistota je závislá na specifitě protilátky a přesném typu použité afinitní purifikace.

Výhody rekombinantních proteinů

Nativní proteiny nebo proteiny exprimované endogenně mohou být, a také jsou, využívány v mnoha biochemických aplikacích. Mají přirozenou strukturu, posttranslační modifikace a svou původní aktivitu. Proč jsou tedy rekombinantní proteiny v proteomice tolik využívány? Výhody použití rekombinantních proteinů jsou následující:

• Množství rekombinantního proteinu může být kontrolováno. Některé následné testy a analýzy vyžadují miligramy nebo dokonce gramy purifikovaného proteinu. Získat takové množství proteinu v nativním stavu by bylo složité a nákladné.

• Proteiny mohou být purifikovány pomocí univerzální značky. To umožňuje, že i protein, který nemá svou specifickou protilátku, může být purifikován a studován. Purifikace pomocí fúzní značky také zjednodušuje experimenty s vysokou výtěžností („high throughput“), ve kterých musí být izolováno velké množství proteinů.

• Exprese proteinu může být jednoduše ověřena pomocí univerzální značky. To umožňuje i proteinům, ke kterým neexistuje specifická protilátka, aby byly analyzovány pomocí western blottingu.

• Povolení od lokální Etické komise (EK) NENÍ vyžadováno. Protože pro získání nativních lidských proteinů je potřeba účast lidských dobrovolníků, je potřeba povolení od EK (více info viz SÚKL). To má za následek více administrativní práce a čekání na schválení dokumentů.

• Aminokyselinová sekvence může být při použití rekombinantních proteinů velmi jednoduše měněna. Mohou být produkovány různě zkrácené, mutované nebo prodloužené cílové proteiny. Navíc mohou být poměrně jednoduše připraveny i chimerické proteiny s pozměněnou či vylepšenou funkcí.

• Do rekombinantních proteinů mohou být inkorporovány nepřirozené aminokyseliny. To je možné za použití modifikovaných aminoacyl-tRNA syntetáz [12]. Nepřirozené aminokyseliny mohou do proteinu vnést unikátní vlastnosti, jako je zesílená enzymatická aktivita nebo stabilita.

• Rekombinantní proteiny jsou levnější než přirozené proteiny. Jakmile je expresní vektor syntetizován a otestován, proces exprese a purifikace rekombinantních proteinů vyjde v přepočtu na miligram levněji než purifikace nativních proteinů.

• Některé aplikace nevyžadují, aby byl protein správně složen a plně aktivní. Pokud protein nemusí být složen, správně složen nebo aktivní, je mnohem ekonomičtější vyprodukovat rekombinantní proteiny než izolovat nativní proteiny. Obzvláště expresní systém využívající coli je velmi nízkonákladový.

Aplikace rekombinantních proteinů ve výzkumu

Produkce protilátek

Pro produkci protilátek jsou zvířecí hostitelé několikrát naočkováni purifikovaným proteinem, aby byla vyvolána primární a sekundární imunitní odpověď [13]. Pro produkci protilátky jsou většinou vyžadovány miligramy proteinu, ačkoliv množství je úměrné velikosti zvířecího hostitele. Myš tak například vyžaduje celkem cca 0.5 mg proteinu, zatímco velké zvíře, jako je ovce, vyžaduje cca 4 mg. Když hladina imunoglobulinu izotypu IgG dosáhne svého sérologického maxima, je odebrána zvířecí krev. Avšak pro získání protilátek se dají použít i jiné typy vzorků než krev (např. kuřecí vajíčka). Výhodou použití rekombinantního proteinu místo krátké aminokyselinové sekvence reprezentující pouze část proteinu (např. peptid) je, že protein obsahuje více potenciálně imunogenních míst. Proto jsou proteiny považovány za obecně více imunogenní než kratší peptidy.

Vývoj aptamerů

Aptamery, neboli protilátky založené na nukleové kyselině vyprodukované in vitro, taktéž využívají rekombinantní proteiny (Obrázek 4). Rekombinantní protein je nejprve inkubován s biliony náhodných RNA nebo DNA oligonukleotidů. Sekvence, které se navážou na protein, jsou poté posbírány a několikrát namnoženy. Je taktéž možné v tomto kroku provést negativní selekci, aby bylo zajištěno, že se aptamer nebude vázat k proteinům podobným proteinu v oblasti zájmu (např. wild-type oproti mutantu, izoforma 1 oproti izoformě 2, atd.). Nakonec jsou aptamery vážící se k cílovému proteinu sekvenovány a následně je ověřována vazebná afinita každého jednotlivého aptameru.

Obrázek 4: Aptamer vážící se na protein. Aptamer zaujímá trojrozměrnou strukturu, aby se mohl specificky navázat na protein nebo molekulu.

Kontroly pomocí Western blottingu

Western blotting je často využíván ke stanovení, zda-li a v jaké míře je požadovaný protein exprimován ve vzorku. Rekombinantní proteiny jsou využívány jako pozitivní kontroly pro Western blotting, aby se zajistilo, že procedura western blottingu (včetně primární protilátky) byla úspěšná. Rekombinantní proteiny jsou taktéž využívány k ověření toho, jak přesně daný protein migruje v gelu. Například protein p53 má velikost 44 kDa, ale migruje na úrovni hmoty 53 kDa (proto také dostal jméno „p53“) [14]. Není nutné použít purifikovaný rekombinantní protein jakožto pozitivní kontrolu. Náklady na nepurifikované rekombinantní proteiny jsou ve skutečnosti pouze zlomkem ceny za purifikované proteiny.

Použití jakožto standardů pro metodu ELISA

Enzymová imunosorbentní analýza (ELISA) je technika, jež měří koncentraci zkoumaného proteinu. Vyčištěný rekombinantní protein je nejprve kvantifikován pomocí metody, jako je test na kyselinu bicinchoninovou (BCA assay). Rekombinantní protein se poté zředí, aby se stanovila standardní křivka pro stanovení přesné koncentrace proteinu ve vzorku.

Proteinové interakce

Interakce proteinů s jinými proteiny, DNA nebo malými molekulami jsou charakterizovány  pomocí rekombinantních proteinů, ať už v roztoku nebo na pevném substrátu [15]. Tato data mohou zahrnovat informace týkající se vazebných partnerů, vazebné afinity nebo kinetiky získané pomocí technik, jako je imunoprecipitace, izotermická kalorimetrie a povrchová plazmonová rezonance (SPR). Lze také charakterizovat specificitu protilátky a modifikace proteinu během enzymatických reakcí. Je důležité vzít v úvahu expresní systém a fúzní značky rekombinantních proteinů pro tyto typy funkčních testů. Například glutathion S-transferáza (GST) nemusí být nejlepší značkou. Kromě své velké velikosti (26 kDa), která by mohla blokovat potenciální vazebná místa, ovlivní její dimerizace molaritu a následnou vazebnou kinetiku a afinitu.

Struktura proteinu

K určení struktury proteinu se používá rentgenová krystalografie, nukleární magnetická rezonance (NMR) a hmotnostní spektrometrie. Rentgenová krystalografie vytváří elektronovou mapu za použití minimálně 5 – 10 miligramů purifikovaného krystalizovaného rekombinantního proteinu [16]. NMR aplikuje magnetické pole a radiofrekvence na 2 – 30 mg purifikovaného proteinu k měření vzdálenosti mezi atomovými jádry [17]. A ačkoli je to méně časté než rentgenová krystalografie a NMR, lze ke stanovení struktury proteinu použít také hmotnostní spektrometrii [18]. Stručně řečeno, hmotnostní spektrometrie měří množství výměny deuterium-vodík po inkubaci proteinu v roztoku na bázi deuteria. Množství inkorporovaného deuteria odráží umístění aminokyseliny vzhledem k pufru, takže peptidy na povrchu proteinu budou mít více deuteria než peptidy ve střední části proteinu.

Experimenty zahrnující buněčné kultury

Rekombinantní proteiny se také používají v experimentech s buněčnými kulturami. Pomáhají určit, zda může protein obnovit signalizaci poté, co byla tato dráha inhibována. To může poskytnout informace o tom, proč může být pacient rezistentní na specificky cílené terapie (např. inhibitor sestávající z malé molekuly) [19]. Stejným způsobem mohou rekombinantní proteiny pomoci mapovat relativní umístění (tj. předcházející nebo následné) proteinu v signální dráze. Srovnání divokého typu a mutantních rekombinantních proteinů na úrovni buněčného fenotypu může pomoci vymezit jejich přirozenou funkci v homeostáze a při onemocnění.

Profilování protilátek

Protilátky odrážejí imunitní odpověď. Protilátkové biomarkery jako takové byly identifikovány pro různá onemocnění, včetně rakoviny, roztroušené sklerózy a artritidy [20-22]. Protilátkové profilování je možné pomocí tzv. proteinových „arrays“ či čipů, kde jsou rekombinantní proteiny vytištěny na pevný substrát v uspořádaném a adresovatelném formátu. Arrays jsou obvykle testovány pomocí séra nebo plazmy, během nichž se sérologické protilátky vážou na svůj specifický antigen. Array se promyje, aby se odstranily nenavázané protilátky, a pro detekci se použije sekundární protilátka proti lidským proteinům, která je konjugovaná s fluoroforem. Protilátkové biomarkery jsou poté rozpoznány porovnáním vzorců napříč skupinami vzorků (např. zdraví oproti nemocným).

Vylepšená nebo pozměněná funkce

Syntéza genu, první krok produkce rekombinantního proteinu, umožňuje snadnou změnu proteinové sekvence. To vědcům umožnilo vylepšit nebo pozměnit funkci bílkovin, což se týká zejména enzymů. Například divoký typ dehalogenázy z bakterií Xanthobacter váže a uvolňuje chloroalkany. Mutace Histidinu 272 na Phenylalanin vede ke kovalentní interakci mezi mutovanou dehalogenázou a chloralkanovým ligandem [23]. Zmutovaná dehalogenáza zvaná HaloTag® se nyní používá jako fúzní značka, která nabírá na popularitě, protože se kovalentně váže na svůj ligand. Autolýza proteázy trypsinu je redukována redukční metylací [24]. Mutovaný trypsin je nejběžnější proteázou používanou při hmotnostní spektrometrii „zdola nahoru“ (bottom-up; tj. identifikace peptidu k proteinu).

Souhrn

Rekombinantní proteiny jsou neocenitelné ve výzkumu proteomiky. Ve srovnání s nativními proteiny mají rekombinantní proteiny dvě hlavní výhody: 1.) větší flexibilitu, pokud jde o to, které a kolik rekombinantních proteinů je produkováno, a 2.) purifikované rekombinantní proteiny jsou levnější než purifikace nativních proteinů. Výběr vhodného rekombinantního proteinu pro aplikaci není podřadným úkolem. Výzkumník by si měl položit několik základních otázek: Je potřeba protein přečistit? Musí být protein aktivní? Potřebuje mít protein specifické posttranslační modifikace (PTM)? Bude značka nebo umístění značky interferovat s následnými testy? Funkční testy, které vyžadují aktivní protein, by měly buď získat proteiny, které již byly testovány na aktivitu, nebo byly produkovány v podobném prostředí exprese. Proteiny, které vyžadují posttranslační modifikace (PTM), by měly být exprimovány v systémech schopných PTM. Velké značky mohou blokovat vazebné epitopy. Užitečnost a univerzálnost rekombinantních proteinů ve výzkumu se odráží ve velké (tj. desítky tisíc) a stále rostoucí nabídce komerčně dostupných rekombinantních proteinů. Kromě toho lze rekombinantní proteiny, které nejsou na trhu, vyrábět pomocí zákaznických proteinových služeb.

Zdroje

1. Kastenhuber ER, Lowe SW. Putting p53 in Context. Cell. 2017;170(6):1062-1078.

2. Gu B, Zhu WG. Surf the post-translational modification network of p53 regulation. Int J Biol Sci. 2012;8(5):672-684.

3. Chan WM, Siu WY, Lau A, Poon RY. How many mutant p53 molecules are needed to inactivate a tetramer? Mol Cell Biol. 2004;24(8):3536-3551.

4. Quax TE, Claassens NJ, Soll D, van der Oost J. Codon Bias as a Means to Fine-Tune Gene Expression. Mol Cell. 2015;59(2):149-161.

5. Kim TK, Eberwine JH. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal Bioanal Chem. 2010;397(8):3173-3178.

6. Rosano GL, Ceccarelli EA. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol. 2014;5:172.

7. Dean DA, Gasiorowski JZ. Liposome-mediated transfection. Cold Spring Harb Protoc. 2011;2011(3):prot5583.

8. Subedi GP, Johnson RW, Moniz HA, Moremen KW, Barb A. High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. J Vis Exp. 2015(106):e53568.

9. James NE, Chichester C, Ribeiro JR. Beyond the Biomarker: Understanding the Diverse Roles of Human Epididymis Protein 4 in the Pathogenesis of Epithelial Ovarian Cancer. Front Oncol. 2018;8:124.

10. Mayes EL. Immunoaffinity purification of protein antigens. Methods Mol Biol. 1984;1:13-20.

11. Kimple ME, Brill AL, Pasker RL. Overview of affinity tags for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. 2013;73:Unit 9 9.

12. Wals K, Ovaa H. Unnatural amino acid incorporation in E. coli: current and future applications in the design of therapeutic proteins. Front Chem. 2014;2:15.

13. Murphy K, Travers P, Walport M, Janeway C. Janeway’s immunobiology. 8th ed. New York: Garland Science; 2012.

14. Linzer DI, Levine AJ. Characterization of a 54K dalton cellular SV40 tumor antigen present in SV40-transformed cells and uninfected embryonal carcinoma cells. Cell. 1979;17(1):43-52.

15. Meyerkord CL, Fu H. Protein-protein interactions : methods and applications. Second edition. ed. New York: Humana Press; 2015.

16. Dessau MA, Modis Y. Protein crystallization for X-ray crystallography. J Vis Exp. 2011(47).

17.  Marion D. An introduction to biological NMR spectroscopy. Mol Cell Proteomics. 2013;12(11):3006-3025.

18. Tsutsui Y, Wintrode PL. Hydrogen/deuterium exchange-mass spectrometry: a powerful tool for probing protein structure, dynamics and interactions. Curr Med Chem. 2007;14(22):2344-2358.

19. Straussman R, Morikawa T, Shee K, et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 2012;487(7408):500-504.

20. Gavrila BI, Ciofu C, Stoica V. Biomarkers in Rheumatoid Arthritis, what is new? J Med Life. 2016;9(2):144-148.

21. Harris VK, Tuddenham JF, Sadiq SA. Biomarkers of multiple sclerosis: current findings. Degener Neurol Neuromuscul Dis. 2017;7:19-29.

22. Jaras K, Anderson K. Autoantibodies in cancer: prognostic biomarkers and immune activation. Expert Rev Proteomics. 2011;8(5):577-589.

23. England CG, Luo H, Cai W. HaloTag technology: a versatile platform for biomedical applications. Bioconjug Chem. 2015;26(6):975-986.

24. Rice RH, Means GE, Brown WD. Stabilization of bovine trypsin by reductive methylation. Biochim Biophys Acta. 1977;492(2):316-321.

(Převzato od společnosti RayBiotech, redakčně upraveno.)