Enzymová imunosorbentní analýza (ELISA), někdy označovaná též jako enzymová imunoanalýza (EIA), je oblíbená, jednoduchá, levná a efektivní metoda stanovení různých analytů. Využívá enzymy, protilátky a antigeny k detekci látek v kapalném vzorku, jako je sérum nebo plazma, supernatant buněčné kultury a lyzát buněk či tkání. ELISA se řadí mezi tzv. mokré laboratorní analytické metody. Rozdíl oproti tzv. suchým metodám spočívá v tom, že suché metody mohou využívat suché detekční proužky.
ELISA je technika stanovení látek za použití destiček: zahrnuje použití pevného povrchu – obvykle polystyrénové vícejamkové destičky – který odlišuje ELISA od jiných analytických testů založených na protilátkách. U ELISA metody je analyt (analyzovaná látka) ve vzorku imobilizován na pevném povrchu, zatímco ostatní složky ve vzorku jsou odstraněny roztokem detergentu. Pevný povrch tímto způsobem umožňuje oddělení analytu od vzorku. Po imobilizaci analytu se přidá detekční protilátka spojená s enzymem, čímž vznikne komplex antigen-protilátka. Nakonec se pro reakci s enzymem přidá enzymatický substrát. Enzymatická reakce pak generuje viditelný signál, obvykle změnu barvy, kterou lze měřit.
Vzhledem ke své jednoduchosti a účinnosti má ELISA široké uplatnění v diagnostice nemocí, biomedicínském výzkumu i v různých průmyslových odvětvích. Metodou ELISA lze detekovat prakticky jakýkoliv typ molekuly (proteiny, lipidy, sacharidy, nukleové kyseliny atd.). Využití metody ELISA k určení koncentrací protilátek či antigenů v séru pomáhá diagnostikovat infekční onemocnění způsobená viry, bakteriemi a jinými patogeny. K dispozici jsou komerčně dostupné ELISA kity pro diagnostiku HIV/AIDS, chřipky, nachlazení, cholery, viru západonilské horečky (WNV), tuberkulózy, hepatitidy B a mnoha dalších infekčních onemocnění u lidí a zvířat. ELISA se také využívá jako diagnostický nástroj v patologii rostlin. Kromě toho se ELISA aplikuje na vývoj vakcín, screening léků či domácí těhotenský test. V potravinářském průmyslu je ELISA užitečným nástrojem k zajištění bezpečnosti a kvality potravin, protože dokáže detekovat škodlivé látky v potravinách, např. alergeny.
Jak ale vybrat z tolika komerčně dostupných ELISA kitů ten správný, pokud potřebujete metodou ELISA detekovat vaše vzorky? Existuje mnoho typů ELISA analýz – přímá, nepřímá, sendvičová a kompetitivní. Většina dodavatelů nabízí ELISA kity s 96 testy (96T) a někteří dodavatelé nabízejí i testovací ELISA kity pro 24 vzorků (24T). Kromě typů ELISA a specifikací balení existují však další důležité faktory, které byste měli při výběru ELISA kitu vzít v úvahu. Zde je 11 tipů pro výběr správného ELISA kitu pro vaše vzorky.
1. Studovaný taxonomický druh
Pokud je vzorek z klasického modelu, jako je člověk, myš nebo krysa, je relativně snadné najít validovaný ELISA kit. Pochází-li však vzorek z neklasického modelu, jako je například opice, je k dispozici pouze omezený počet komerčních kitů. V takovém případě budete možná muset zvolit kit ověřený na druhu, který vykazuje homologii s druhem ve vašem vzorku.
2. Detekovaný analyt
Měli byste přesně vědět, jaký druh analytu (obvykle bílkoviny) chcete detekovat. Sendvičová ELISA je obecně vhodná pro detekci velkých proteinů s více epitopy, jako je např. cytokin. Pro detekci malých molekul, jako jsou např. hapteny, je vhodná kompetitivní ELISA.
Většina komerčních ELISA kitů je validována na séru nebo plazmě a supernatantech buněčných kultur. Abyste si tedy mohli být jistí, že je sada kompatibilní s vaším vzorkem, je důležité si podrobně přečíst pokyny k produktu. Například i způsob odběru vzorků plazmy (heparin nebo EDTA) může ovlivnit, který ELISA kit zvolit. Dále mohou ovlivnit účinnost testu faktory, jako jsou například hemolýza či přítomnost lipidů ve vzorku. Před výběrem ELISA kitu je tedy potřeba vzít v úvahu všechny tyto faktory. K ověření, zda je souprava vhodná a dostatečně citlivá pro váš vzorek, doporučujeme zakoupit zkušební ELISA kit dostatečné velikosti k provedení předběžného testu s vašimi vzorky.
3. Účel analýzy
ELISA je nástroj, který lze použít jak pro kvalitativní, tak i pro kvantitativní analýzy. Kvalitativní ELISA poskytuje jednoduchý pozitivní nebo negativní výsledek vzorku, zatímco kvantitativní ELISA odráží koncentraci analytu ve vzorku pomocí standardní křivky. Je proto potřeba předem rozhodnout, zda chcete kvantifikovat analyt ve vašem vzorku nebo jen zjistit jeho přítomnost. Dle daného účelu analýzy si tedy můžete vybrat kvalitativní nebo kvantitativní ELISA kit.
4. Typ protilátek
Obvykle je možno se poradit s dodavateli ELISA kitů, jaké typy protilátek se v soupravě používají: zda-li monoklonální nebo polyklonální protilátky. U sendvičového ELISA kitu je občas výhodné použít polyklonální protilátku k zachycení a monoklonální protilátku k detekci.
5. Požadavek na citlivost
Pokud nemáte přesnou představu o koncentraci analytu ve vašem vzorku, pak je vhodnou volbou ELISA kit se širokým detekčním rozsahem. Pokud je koncentrace analytu ve vzorku velmi nízká, doporučují se ELISA kity s vysokou citlivostí. Pokud je naopak koncentrace analytu příliš vysoká, lze provést ředění vzorků, aby se vzorek přizpůsobil detekčnímu rozsahu ELISA kitu.
6. Velikost vzorku
ELISA kity obvykle vyžadují od 100 ul do 10 ul vzorku. Pokud je množství vašeho vzorku velmi malé nebo je váš vzorek velmi vzácný, raději zvolte takové ELISA kity, které vyžadují menší množství vzorku.
7. Výtěžnost a linearita
K posouzení vlastností ELISA kitů se používají experimenty výtěžnosti a linearity. Výtěžnost pomáhá určit, zda je detekce analytu ovlivněna rozdíly v matricích vzorků. Vysoká výtěžnost je lepší. Linearita ředění určuje rozsah, ve kterém je množství, tedy odezva analytu, lineární při konkrétním stupni ředění. V ideálním případě by měla být koncentrace analytu ve vzorcích po všech ředěních obdobná.
Většina dodavatelů poskytuje údaje o výtěžnosti a linearitě ve specifikacích produktu. Kromě toho jsou k dispozici také další důležité parametry, jako je citlivost a dynamický rozsah. ELISA kity různých výrobců mohou mít různé parametry. Údaje o parametrech, zejména údaje o výtěžnosti a linearitě, můžete pečlivě porovnat a vybrat správný ELISA kit.
8. Detekční systém
Pro ELISA kity existuje několik různých detekčních systémů, včetně kolorimetrických, fluorescenčních a luminiscenčních metod. Všechny testy ELISA zahrnují imobilizaci analytu na povrch a také použití enzymové značky a odpovídajícího substrátu. Velmi důležitý je výběr vhodného enzymu a odpovídajícího substrátu. Kromě toho by měly být správně zvoleny podmínky reakce enzym-substrát, mikrodestička a detekční zařízení.
9. Experimentální protokol
ELISA kity s jednoduchými protokoly, pohodlnými úkony a krátkou dobou experimentu vám usnadní provedení testu ELISA.
10. Reference
ELISA kity, které používají jiní vědci a jsou často uváděny v literatuře, jsou obvykle důvěryhodnější. Výrobci a výrobky, které obdržely certifikaci, jsou navíc obecně spolehlivější.
11. Cena
Cena je vždy důležitým faktorem výběru, zvláště pokud máte omezený rozpočet. ELISA kity jsou obvykle pro stanovení 96 jednotlivých testů (96T). Rovněž je třeba vzít v úvahu náklady na dopravu.
(Převzato od společnosti CUSABIO, redakčně upraveno.)