Pokud se zabýváte či se chystáte zabývat genovou expresí, určitě jste již narazili na pojmy ‘sekvenování transkriptomu’ (RNA-seq) a ‘kvantitativní PCR’ (real-time PCR). Ačkoli se základní principy těchto dvou technik liší, obě mohou z jakéhokoliv typu vzorku poskytnout informace o množství (absolutním nebo relativním) izolovaného mRNA.
Pokud začínáte s výzkumem nebo se pouštíte do analýzy genové exprese poprvé, možná si kladete otázku – pokud obě techniky fungují, proč upřednostnit jednu před druhou? V tomto příspěvku se vám pokusíme na tuto otázku odpovědět!
Začněme rekapitulací
RNA-seq používá technologii sekvenování nové generace (NGS) k poskytování záznamu o počtu a identitě RNA molekul v jakémkoli vzorku v daném čase a za daných podmínek. Ke specifické analýze mRNA lze do pracovního postupu přidat krok nabohacení mRNA. V nabohacených vzorcích se poté mRNA reverzně transkribuje na komplementární DNA (cDNA), která se poté převede do sekvenační knihovny. Tato knihovna je zpracována v sekvenátoru a výstup je poté tříděn do kvantitativních seznamů transkriptů přítomných v každém vzorku. Výstupní data takového RNA-seq experimentu budou obsahovat většinu nebo všechny mRNA přítomné ve vzorku (vzorcích) v okamžiku sběru. Jinak řečeno, RNA-seq je technika “všezachytávajícího” typu (catch-all).
Real-time PCR je naopak přístup více cílený na analýzu genové exprese. Celková RNA je podrobena reverzní transkripci a výsledná cDNA je amplifikována pomocí specifických primerů v kvantitativní PCR reakci. Do PCR reakce jsou začleněny fluorescenční sondy, které vážou DNA (cílově specificky), nebo fluorescenční barviva vázající dsDNA (nespecificky). Úroveň fluorescence emitované během amplifikace odpovídá množství cílené sekvence přítomné ve vzorku. Kvůli požadavku na primery specifické vůči cílové frekvenci a / nebo sondy pro každý sledovaný gen není real-time PCR catch-all technikou. S dobrou sadou cílově specifických sond, které vážou DNA, je však možné provést vícečetnou analýzu, tj. analyzovat několik cílených sekvencí ve stejném vzorku současně.
Který z nich je tedy nejlepší?
Tvrdit, že je jedna technika lepší než druhá, by nebylo fér. Obě nabízejí citlivou a spolehlivou kvantifikaci transkriptu, avšak v závislosti na vašich výzkumných cílech pro vás může být jeden způsob lepší než druhý. Podívejme se na některé z hlavních faktorů, které byste měli zvážit při rozhodování, který způsob zvolit.
1. S kolika geny pracujete?
Chcete-li vidět, co se stane s celým transkriptomem, pokud určitým způsobem upravíte zkoumaný organismus / buněčnou linii / tkáň, pak je cestou RNA-seq. Získáte celkový obraz o tom, jak jsou regulovány jednotlivé geny přítomné ve zkoumaném organismu, zda je exprese zvýšena či snížena (nebo nezměněna) v reakci na zvolenou úpravu/y. Výzkum kompletního transkriptomu je často ideální v počátcích projektu, kdy zatím není úplně jasné, na které geny stojí za to se zaměřit, například:
● Najít potenciální geny spojené s onemocněním porovnáním transkriptomů zdravé vs. nemocné tkáně
● Rozluštit mechanismus působení nové zajímavé sloučeniny studiem jeho vlivu na genovou expresi
● Studovat celkovou transkripční reakci na sloučeniny významné pro životní prostředí, jako jsou pesticidy a fungicidy
● Pro charakterizaci nového transkripčního faktoru: vyřaďte/omezte jej a použijte výsledný transkripční profil k získání informací o tom, které geny jsou tímto transkripčním faktorem regulovány
Pokud již víte, které geny jsou pro váš výzkum zajímavé, pak by mohlo být použití RNA-seq přehnané. Pokud máte dobré primery a nastavení real-time PCR, které spolehlivě detekuje a kvantifikuje vaše cílové geny, pak pravděpodobně není úplně nutné pouštět se do RNA-seq. Pokud nezkoumáte velké množství genů, real-time PCR bude pravděpodobně i finančně dostupnější než RNA-seq.
2. Zajímáte se o studium regulace genové exprese?
Řekněme, že vaše laboratoř obvykle studuje určitou skupinu genů pomocí real-time PCR, ale vy byste chtěli pochopit, jak jsou tyto geny regulovány a nevíte, kde začít. Pro začátek může být skvělou cestou právě RNA-seq. Jednou z možných strategií je srovnání toho, co se stane se všemi transkripčními faktory organismu a jinými regulačními geny, když zkoumáte aktivitu svých cílových genů, např. vystavením zkoumaných buněk stimulům, které iniciují dráhy, do nichž jsou zapojeny zkoumané geny, a studujete transkripční odpovědi.
Kromě výše popsaného scénáře je RNA-seq ideální postup také pro ty, kteří chtějí současně sledovat genovou expresi a regulaci pomocí analýzy kódující a nekódující RNA. Toho lze dosáhnout pomocí RNA-seq vynecháním jakéhokoliv nabohacovacího kroku před syntézou cDNA. Pokud vzorky nejsou nabohaceny o mRNA, pak by teoreticky měla být sekvenována každá přítomná molekula RNA, včetně mRNA, tRNA, malých nekódujících RNA a dalších.
3. Chcete přejít do režimu objevování?
Real-time PCR vyžaduje dvojici primerů specifických vůči cílové sekvenci pro každý sledovaný gen, stejně jako cílově specifické sondy, pokud nepoužíváte nespecifické barvivo vázající dsDNA, jako je SYBR Green. To znamená, že metoda real-time PCR vyžaduje, abyste znali sekvenci genů, které chcete studovat, a je tudíž nevhodná pro objevování neanotovaných alternativních transkriptů, variant a zcela neznámých genů.
Reakce RNA-seq na druhé straně nevyžaduje žádné předchozí znalosti sekvence, což vám v případě potřeby umožňuje provádět ve velkém měřítku objev genů bez předchozí hypotézy. Stručně řečeno, měli byste použít RNA-seq, pokud chcete najít nové geny, transkripty a varianty.
Nejlepší z obou variant
Kromě výše uvedených úvah, které jsou zaměřeny na výzkumné cíle, mohou vaši volbu analytické techniky ovlivnit další faktory, jako je dostupnost zařízení, přístup k sekvenci genomu, rozpočtová omezení a laboratorní znalosti. Ve skutečnosti však výzkumné skupiny často ke splnění svých potřeb nakonec používají obě techniky. To platí zejména pro ty, jejichž výchozím bodem je RNA-seq, a kde se pak k ověření sekvenčních dat použije real-time PCR.
(Převzato od společnosti Nordic BioSite, redakčně upraveno.)