Trápí vás MYKOPLAZMA? Máme pro vás řešení

Úvod

Kontaminace kultivovaných buněk mykoplazmou je hlavním problémem jak v základním výzkumu, tak v průmyslové výrobě. Až 87 % buněčných linií může být kontaminováno mykoplazmou.^1,2 Na rozdíl od bakteriálních nebo houbových kontaminací nelze mykoplazmatické kontaminace detekovat vizuálně.

Mykoplazmy mohou drasticky změnit vaše buňky a následně zkreslit výsledky celého výzkumu.

Mykoplazmy jsou nejmenší volně žijící organismy a považují se za nejjednodušší bakterie. Patří k bakteriální třídě Mollicutes, jejíž členové se vyznačují nepřítomností buněčné stěny. První kmeny mykoplazmy byly izolovány v Pasteurově institutu v roce 1898. Od tohoto roku bylo z asi 190 známých druhů identifikováno 20 druhů způsobujících kontaminaci buněčných kultur. Mykoplazmata využívají hostitelské buňky k pokrytí svých požadavků na energii a biosyntézu.

Vzhledem k jejich malým rozměrům (~ 100 nm) nejsou mykoplazmy detekovatelné okem nebo optickým mikroskopem. Díky nepřítomnosti buněčné stěny jsou odolné vůči běžným antibiotikům, jako je penicilin a streptomycin. Kontaminace buněčné kultury mykoplazmou neprovází zakalení typické pro bakteriální nebo houbovou kontaminaci. Navíc i následné morfologické změny nebo rychlost růstu kultury může být minimální nebo jednoduše nepopsatelná.

Důsledky kontaminace mykoplazmou v buněčných kulturách

Mykoplazmy soutěží s hostitelskou buňkou o biosyntetické prekurzory a živiny a mohou změnit syntézu DNA, RNA a proteinů, snížit hladiny aminokyselin a ATP, zavádět chromozomální změny a modifikovat plazmové membránové antigeny hostitelských buněk. Microarray analýza kontaminovaných kultivovaných lidských buněk odhalila závažné účinky mykoplazmat na expresi stovek genů, včetně těch, které kódují receptory, iontové kanály, růstové faktory a onkogeny⁴. Kromě toho mají mykoplazmy významné účinky na kultivované imunitní buňky, jako jsou monocyty a makrofágy. Mykoplazmy obsahují vysoce imunogenní lipoproteiny zakotvené na vnější straně plazmatické membrány. Tyto lipoproteiny jsou rozpoznávány specifickými receptory pro rozpoznávání vzoru na imunitních buňkách – zejména TLR2. Po rozpoznání mykoplazmálních lipoproteinů indukuje TLR2 cestu NF-kB, což vede k aktivaci těchto buněk a následně k ovlivnění experimentálních výsledků.

Jak si s mykoplazmou poradit?

Existují tři hlavní zdroje kontaminace buněčných kultur mykoplazmou v laboratoři: infikované buňky poslané z jiné laboratoře; kontaminovaná činidla např. sérum a trypsin; infikovaní pracovníci laboratoře. Dále se kontaminace může rychle šířit do jiných buněčných linií prostřednictvím disperze aerosolových kapiček. Jakmile dojde k detekci mykoplazmy, nejlepším řešením je odstranění kontaminované buněčné linie. Cenné buněčné linie mohou být léčeny produkty na eradikaci mykoplazmy včetně mykoplazma selektivních antibiotik. Bylo prokázáno, že tyto produkty eliminují mykoplazmu a obnovují chování a reakce buněk během dnů nebo týdnů po léčbě⁵.

InvivoGen nabízí snadnou a spolehlivou metodu detekce mykoplazmat PlasmoTest^TM. Tento test využívá schopnosti imunitního systému (zejména TLR2) rozpoznat mykoplazmy a může být snadno implementován do vašich postupů pro buněčné kultury, což umožňuje rutinní kontroly všech typů kontaminace mykoplazmou. InvivoGen také nabízí produkty pro léčbu kontaminovaných buněčných kultur, dobře známý produkt Plasmocin^TM a Normocin^TM, který se používá pro zabránění kontaminaci mykoplazmou, bakteriemi a houbami.

Reference:

1. Robinson LB. et al., 1956. Contamination of human cell cultures by pleuropneumonia like organisms. Science. 124(3232):1147-8

2. Armstrong SE. et al., 2010. The scope of mycoplasma contamination within the biopharmaceutical industry. Biologicals. 38(2):211-3

3. Olarerin-George AO. and Hogenesch JB., 2015, Assessing the prevalence of mycoplasma contamination in cell culture via a survey of NCBI’s RNA-seq archive, Nucleic Acids Research, (5):2535-42

4. Miller CJ. et al., 2003. Mycoplasma infection significantly alters microarray gene expression profiles. Biotechniques. 35(4):812-4

5. Zakharova E. et al., 2010. Mycoplasma suppression of THP-1 Cell TLR responses is corrected with antibiotics. PLoS One. 5(3):e9900

Detekce

PlasmoTest^TM – detekční kit na mykoplazmu

Testujte své kultury pravidelně!

PlasmoTest^TM je jednoduchý, rychlý a spolehlivý kolorimetrický test pro vizuální detekci kontaminace mykoplazmou v buněčných kulturách. Tento test využívá schopnost TLR2 rozpoznat mykoplazmy a vyvolat signalizační kaskádu vedoucí k aktivaci NF-kB a dalších transkripčních faktorů.

Test obsahuje dvě hlavní součásti: buňky, které detekují přítomnost mykoplazmy a detekční médium HEK-Blue^TM. Senzorové buňky rozpoznávají mykoplazmy pomocí Toll-like Receptoru 2 (TLR2), receptoru pro rozpoznávání patogenů. V přítomnosti mykoplazmat je iniciována TLR2 signalizační kaskáda vedoucí k aktivaci NF-kB a dalších transkripčních faktorů. Tyto transkripční faktory indikují vylučování SEAP (sekretované embryonální alkalické fosfatázy) v supernatantu, což je snadno rozpoznáno zfialověním/zmodráním detekčního media HEK-Blue^TM.

Využití aktivace TLR2 receptoru v mykoplazma detekčním kitu

Výhody:

• vyžaduje pouze základní znalosti o buněčných kulturách
• příprava testu vyžaduje méně než 1 hodinu, výsledky získáte inkubací přes noc
• detekuje všechny kontaminanty buněčné kultury
• detekuje 5.10² – 5.10⁵ cfu/ml mykoplazmat
• žádné falešně pozitivní výsledky: pozitivní výsledek naznačuje přítomnost kontaminantu buněčné kultury
• testuje až 250 vzorků
• pro provedení dalších testů stačí pouze doplnit reagencie

Příklady článků, ve kterých byl použit InvivoGen PlasmoTest^TM:

• 2017 – Nat Commun., 8(1):2103. PI3Kδ activates E2F1 synthesis in response to mRNA translation stress. Gnanasundram SV. et al.
• 2017 – Toxicology, S0300-483X(17)30059-8. Effect of Interleukin (IL)-8 on benzo[a]pyrene metabolism and DNA damage in human lung epithelial cells. Shi Q. et al.
• 2016 – Nature., 538(7623):123-126. Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I. Stroud DA. et al.
• 2016 – Nat Protoc., 11(11):2170-2188. Remodeling somatic nuclei via exogenous expression of protamine 1 to create spermatid-like structures for somatic nuclear transfer. Czernik M. et al.
• 2016 – J Control Release., 226:238-47. Transcending epithelial and intracellular biological barriers; a prototype DNA delivery device. McCaffrey J, McCrudden CM, Ali AA, Massey AS, McBride JW, McCrudden MT, Vicente-Perez EM, Coulter JA, Robson T, Donnelly RF, McCarthy HO

Eliminace a prevence kontaminace

Opravdu jsou vaše buněčné kultury bez mykoplazmat? Vyzkoušejte antimykotika.

Plasmocin™

Plasmocin Prophylactic je vysoce citlivé širokospektrální anti-mykoplazmatické činidlo. Může být používáno jako „rutinní přídavek“ ke kapalnému médiu, aby se zabránilo kontaminaci mykoplazmou a příbuznými bakteriemi bez buněčné stěny v savčích buněčných kulturách. Je aktivní proti četným mykoplazmatům, jako je M. arginini, M. fermentans, M. laidlawii a M. hyrhinis. Na rozdíl od jiných anti-mykoplazmatických přípravků je Plasmocin aktivní jak na extracelulárních mykoplazmatech, tak na intraceluláních formách. Tato výhoda je poskytována složkou Plasmocinu, která je aktivně transportována do savčích buněk. Plasmocin je aktivní v nízkých koncentracích na širokém spektru grampozitivních bakterií, jako Stafylokok a gramnegativních bakterií jakou jsou E. coli, Enterobakter, Pseudomonas a Alcaligenes. Plasmocin Prophylactic (5 ug/ml) nevykazuje žádnou toxicitu v eukaryotických buňkách. Jeho aktivita není ovlivněna přítomností až 20 % séra v médiu buněčné kultury.

K dispozici dvě varianty:

•  Plasmocin Prophylactic (2.5 mg/ml):k prevenci mykoplazmatické kontaminace, použití při 2.5 – 5 µg/ml při rutinní praxi
•  Plasmocin Treatment (25 mg/ml):k eliminaci mykoplazmatické kontaminace, použití 25 µg/ml po dobu 2 týdnů

Plasmocin^TM je dobře zavedné antimykoplasmatikum. Obsahuje dvě baktericidní složky silně působící proti mykoplazmatům, které umožňují jejich eliminaci za pouhé dva týdny. První složka působí na systém syntézy bílkovin, zatímco druhá působí na replikaci DNA. Tyto dva specifické a oddělené cíle má pouze mykoplazma a další bakterie, v eukaryotických buňkách zcela chybí.

Plasmocin^TM je také účinný v nízkých koncentracích na širokém spektru gram pozitivních a gram negativních bakterií, které jsou jinak odolné vůči směsi streptomycinu a penicilinu. Nevykazuje žádnou toxicitu v eukaryotických buňkách.

Mnoho buněčných linií infikovaných mykoplazmou bylo úspěšně léčeno Plasmocinem¹, včetně primárních rakovinných buněčných linií², buněk produkujících viry³ a indukovaných pluripotentních kmenových buněk⁴, aniž by došlo k trvalým změnám. Dále bylo v nedávné studii zjištěno, že 2 týdenní léčba Plasmocinem účinně léčí kontaminaci mykoplazmat v lidských embryonálních kmenových buňkách bez ovlivnění jejich kmene a pluripotence nebo životaschopnosti⁵.

Tyto produkty jsou vhodné pouze pro výzkumné účely a nikoliv pro péči o člověka nebo zvířata.

Na rozdíl od jiných produktů je Plasmocin^TM aktivní jak na volných mykoplazmatech, tak na intracelulárních formách. Tato výhoda je poskytována jednou složkou Plasmocinu, která je aktivně transportována do savčích buněk. Díky tomu není buněčná kultura reinfekována mykoplazmou uvolňovanou z intracelulárních oddělení infikovaných buněk.

U všech zvířecích buněčných linií, které byly do dnešního dne testovány, dokonce i při pětinásobku pracovní koncentrace, nebyly pozorovány žádné zjevné nepříznivé účinky na buněčný metabolismus.

V kapalných kulturách mykoplazmat nebyla zjištěna rezistence ani při opakovaných pokusech.

Antibiotika běžně používaná v buněčných kulturách na mykoplazmu nepůsobí (např. penicilin a streptomycin). Bylo prokázáno, že přítomnost mykoplazmat se dá léčit třemi třídami antibiotik v relativně nízkých koncentracích: tetracykliny, makrolidy a chinolony. Tetracykliny a makrolidy blokují syntézu bílkovin interferencí s translací ribozomů, zatímco chinolony inhibují replikaci bakteriální DNA.

Pro odstranění mykoplazmy je komerčně dostupných několik antibiotik: BM-cyklin (Roche) obsahuje makrolid a tetracyklin, Ciprobay (Bayer, dostupný pouze na předpis) a MRA (ICN) jsou oba chinolony. Plasmocin^TM je jediné antimykoplasmové činidlo, které kombinuje makrolid a chinolon. Na rozdíl od BM-cyklinu, který vyžaduje postupné a cyklické použití dvou antibiotik, Plasmocin je jediný RTU (ready-to-use) produkt, který lze přidat přímo do kultivačního média.

Kromě toho jsou obě antibiotika BM-Cyclinu inhibitory syntézy proteinů, zatímco antibiotika v Plasmocinu mají odlišné mechanismy: jedno blokuje syntézu proteinů a druhé zastavuje replikaci DNA. Proto je Plasmocin účinnější při odstraňování mykoplazmy a zabraňuje tvorbě rezistentních kmenů.

Dosud nebyly zaznamenány žádné trvalé změny ovlivňující eukaryotické buňky během nebo po léčbě přípravkem Plasmocin. Na léčbu Plasmocinem často odkazují mnohé akademické laboratoře.^2-5

Ve velmi vzácných případech byla hlášena mykoplazmata rezistentní na Plasmocin^TM. Pro vymýcení těchto mykoplazmat (nebo kontaminantů) vyvinul InvivoGen druhé antimykoplazmatické činidlo nazvané Plasmocure^TM. Přestože tento produkt může vést k mírné dočasné toxicitě v průběhu léčby, po odstranění kontaminace se buňky zcela zotaví.

Porovnání přípravků na eradikaci mykoplazmy:

Reference:

1. Olarerin-George AO. and Hogenesch JB., 2015, Assessing the prevalence of mycoplasma contamination in cell culture via a survey of NCBI’s RNA-seq archive, Nucleic Acids Research, (5):2535-42

2. Uphoff CC, Drexler HG, 2005. Eradication of mycoplasma contaminations. Methods Mol Biol. 290:25-34.

3. Uphoff CC et al., 2012. Treatment of mycoplasma contamination in cell cultures with Plasmocin. Biomed Biotechnol. 2012:26767

4. Molla Kazemiha Vet al, 2011 Efficiency of Plasmocin™ on various mammalian cell lines infected by mollicutes in comparison with commonly used antibiotics in cell culture: a local experience. Cytotechnology. Dec;63(6):609-20

5. Romorini L et al, 2013.Effect of antibiotics against Mycoplasma sp. on human embryonic stem cells undifferentiated status, pluripotency, cell viability and growth. Plos One. Jul 30;8(7):e70267

Plasmocure™

Činidlo pro eliminaci mykoplazmy

Plasmocure^TM je vysoce účinný antibiotický roztok k léčbě mykoplazmou kontaminovaných buněčných kultur. Tento roztok je účinný proti různým druhům mykoplazmat, které infikují savčí buněčné kultury včetně M. hyorhinis, M. orale, M. arginini, M. fermentans, M. hominis a Archoleplasma laidlawii, které představují 90 až 95 % kontaminujících kmenů. Plasmocure se doporučuje k odstranění mykoplazmat, která se zdají být rezistentní vůči Plasmocinu.

Cytotoxicita přípravku Plasmocure^TM je nízká, může však být pozorováno zpomalení buněčného růstu. Po ukončení léčby a odstranění Plasmocure^TM z media se buňky rychle vrátí k normální rychlosti růstu.

Plasmocure^TM obsahuje dvě baktericidní složky patřící k různým antibiotickým rodinám. Obě složky inhibují syntézu proteinů, ale používají odlišné mechanismy. První antibiotikum se váže na 50S podjednotku ribozomu a blokuje aktivitu peptidyltransferázy. Druhé antibiotikum se váže na isoleucyl-tRNA syntetázu a zastavuje začlenění isoleucinu do bakteriálních proteinů. Tyto dva specifické a oddělené cíle se nacházejí pouze u mykoplazmat a gram pozitivních bakterií, ale v eukaryotických buňkách zcela chybí. Cytotoxicita přípravku Plasmocure^TM je nízká, nicméně zpomalení buněčného růstu může být pozorováno při vysokých koncentracích v důsledku inhibice respirace mitochondrií. Po ukončení léčby a odstranění Plasmocure^TM z kultivačního média, se buňky rychle vrací ke své normální rychlosti růstu.

Příklady článků, ve kterých autoři použili InvivoGen Plasmocure™ – Mycoplasma Elimination Reagent

1. 2017– Am J Pathol., [Epub ahead of print] Apolipoprotein E promotes invasion in oral squamous cell carcinoma. Jayakar SK. et al.

2. 2016– PLoS One., 11(3):e0150460. Drug Repositioning for Cancer Therapy Based on Large-Scale Drug-Induced Transcriptional Signatures. Lee H, Kang S, Kim W.

3. 2016– Cell Death Dis., 7(8):e2322. TLR and NLRP3 inflammasome-dependent innate immune responses to tumor-derived autophagosomes (DRibbles). Xing Y. et al.

4. 2015– Arch Pathol Lab Med., 139(11):1349-61. MicroRNA-375 suppresses extracellular matrix degradation and invadopodial activity in head and neck squamous cell carcinoma.
Jimenez L, Sharma VP, Condeelis J, Harris T, Ow TJ, Prystowsky MB, Childs G, Segall JE.

5. 2012– Immunity, 36(3):464-476 An NLRP7-containing inflammasome mediates recognition of microbial lipopeptides in human macrophages. Khare S, Dorfleutner A, Bryan NB, Yun C, Radian AD, de Almeida L, Rojanasakul Y, Stehlik C

(Převzato od společnosti Invivogen, redakčně upraveno.)