V roce 1957 studovali Alick lsaacs a Jean Lindenmann vliv tepelně inaktivovaného viru chřipky na růst živého viru ve fragmentech kuřecí chorionické chorioallantoické membrány a zjistili, že tepelně inaktivovaný chřipkový virus inkubovaný s membránami produkoval látku, která narušovala infekci a replikaci živého viru [1].
Tato látka (Interferon-alfa) se tak stala prvním objeveným cytokinem a kvůli svým interferenčním účinkům byla později pojmenována jako interferon.
Poté byly objeveny další typy interferonů a jiných cytokinů. Vědci je pojmenovali podle jejich rozličných funkcí, interleukin (IL), interferon (IFN) a faktor nádorové nekrózy (TNF, tumor necrosis factor), kolonie stimulující faktor (CSF, colony stimulating factor), chemokin, růstový faktor (GF).
Co jsou cytokiny
Cytokiny jsou polypeptidové molekuly o nízké molekulové hmotnosti, které jsou zodpovědné za komunikaci mezi nedalekými buňkami, zejména pak buňkami hematopoetického původu.
Role cytokinů je zásadní v regulaci procesů zahrnujících vrozenou i získanou imunitní odpověď organismu, buněčnou proliferaci a růst, diferenciaci, buněčnou smrt, angiogenesi a vývojové a opravné procesy důležité pro udržení homeostázi [2][3].
Ačkoli jsou cytokiny produkovány především pomocnými T lymfocyty (Th lymfocyty) a makrofágy, mohou být přechodně indukovány a vylučovány téměř všemi jadernými buňkami. Konkrétní cytokin může být produkován více než jedním typem buněk.
Obrázek 1: Různé typy buněk, které produkují cytokiny
Role cytokinů
Cytokiny vykazují biologické účinky díky vazbě na odpovídající cytokinové receptory na buněčném povrchu. Spojení cytokinů a jejich receptorů iniciuje komplexní intracelulární molekulární interakci, která v konečném důsledku způsobují změny v buněčné genové transkripci.
Účinky cytokinů tvoří rozsáhlou síť. Jinými slovy, každý cytokin může působit na řadu buněk; každá buňka může být regulována řadou cytokinů; různé cytokiny mají synergické nebo vzájemně omezující účinky. Samy účinky cytokinů tak přispívají k jejich komplexní regulaci prostřednictvím sítě imunitních drah.
Obrázek 2: Princip, na kterém cytokiny fungují
Proč cytokiny stanovovat
Cytokiny představují biomarkery zánětlivé imunitní odezvy. Protože zvýšené koncentrace cytokinů značí aktivaci cytokinových drah spojených se zánětem nebo vývojem onemocnění, lze každou nemoc spojit s cytokiny, jakožto potenciálními biomarkery[4].
Dále studie ukázaly, že zánět může vytvořit prostředí příznivé pro progresi nádorových onemocnění [5][6]. Stanovení cytokinů je proto velmi důležité. Pomáhá objasnit mechanismus imunitní regulace na molekulární úrovni, zabránit rozvoji onemocnění nebo jej diagnostikovat a léčit [7].
Například interferon-y může být užitečný při léčbě chronického granulomatózního onemocnění [8] a kostní sklerózy [9] a interferonu-α pro léčbu hepatitidy C [10][11] a juvenilní laryngeální papilomatózy [12]. Interferon β se používá k léčbě roztroušené sklerózy [13] a interleukin-2 (IL-2) může léčit různé metastatické rakoviny [14][15][16], zejména při použití technik genetického inženýrství produkujících rekombinantní cytokin, který byl použit k léčbě nádorů, infekcí, zánětů a jiných hematopoetických poruch. Tyto terapie mají dobré výsledky a jsou velmi perspektivní ve velmi široké aplikaci.
Metody detekce cytokinů
• Kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase
Kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase (qPCR) byla použita ke studiu genové exprese a měření míry transkribované cytokinové mRNA. Vývoj mikrofluidní technologie vedoucí k použití pikolitrových objemů pak umožňuje provést PCR na jednobuněčné úrovni [17][18], čímž můžeme obdržet studie cytokinové exprese jedné buňky [19].
Nejprve je zapotřebí vybrat vnitřní kontrolu, jejíž exprese není ovlivněna vývojem organismu a podmínkami experimentu. Jako cílový gen a vnitřní kontrolní křivku bychom měli vybrat a použít přečištěnou dsDNA, transkribovanou RNA a in vitro syntetizovanou ssDNA [20] nebo jakoukoli cDNA exprimující cílový gen.
Následuje optimalizace experimentálních podmínek s cílem dosáhnout konzistentní a účinné amplifikace obou genů, protože rozdílná účinnost reakce vede k nekonzistentním výpočtům výsledku. V poslední fázi je prováděna analýza dat s použitím metody 2-△Ct [21]. Pro hrubý odhad je používán i jednoduchý indikátor tzv. hodnota Ct (cycle treshold).
• ELISA
ELISA (zkratka z anglického enzyme-linked immunosorbent assay) je metoda, která využívá specifickou vazbu molekul protilátky a antigenu.
Od cílového proteinu navázaného na nosiči z pevné fáze je následně oddělen volný heteroprotein protilátky a antigenu, a díky speciálnímu značení je provedena kvantitativní nebo kvalitativní analýza.
Metoda umožňuje detekovat sekretované cytokiny na proteinové úrovni. Enzymatická reakce je zde použita k tvorbě barvy, jejíž intenzita se vztahuje k množství přítomného proteinu.
Metoda ELISA je široce používanou technikou k cytokinové kvantifikaci. Pokud je nutné měřit více cytokinů v jednom vzorku je potřeba vyvinout a měřit celou škálou ELISA. Jedná se o časově náročnou a pracnější techniku vyžadující relativně velké množství vzorku.
Obrázek 3: Sendvičová ELISA
Pro více informací o metodě ELISA a aspektech jednotlivých uspořádání si přečtěte náš náš článek s dalšími detaily.
• ELISpot
ELISpot (z anglického Enzyme Linked Immuno Spot Assay) je technika detekující proteiny pomocí protilátek. Jedná se o upravenou variantu imunoanalýzy ELISA, která umožňuje detekovat cytokiny na úrovni jednotlivých buněk [22-24].
Prostřednictvím ELISpotu jsou stanovovány cytokiny produkované jednotlivými vybranými buňkami, které byly selektovány většinou prostřednictvím buněčného třídění (cell sortingu, průtokového cytometru) [25].
Na mikrotitrační destičku potaženou protilátkou proti stanovovanému cytokinu jsou aplikovány a následně kultivovány buňky, u nichž je předpokládaná sekrece daného cytokinu. Po kultivaci v přítomnosti a bez přítomnosti stimulu jsou sekretované cytokiny testovány díky jejich zachycení na specifické protilátce přítomné na povrchu destičky. Po odmytí zachycených buněk využívá následná reakce na principu ELISA metody enzymaticky značenou primární či sekundární protilátku. Jedna skvrna pak představuje buňky sekretující cytokin. Stupeň zbarvení skvrny pak souvisí s množstvím cytokinu vylučovaného buňkou.
ELISpot T buněk může být použit k charakterizaci populace T lymfocytů. ELISpot detekuje cytokiny IFN-y, IL-2, TNF-a, IL-4, IL-5 a IL-13. První tři cytokiny jsou produkovány buňkami Th1, zatímco poslední tři cytokiny jsou produkovány buňkami Th2. Měření T-buněk prostřednictvím produkce cytokinů je používána také ke studiu účinnosti vakcín [26].
• Cytokinové arraye založené na kuličkách (CBA, cytokiny Bead Array)
Základní myšlenkou technologie arraye na bázi kuliček je, že každý typ kuličky má na svém povrchu specifickou protilátku pro zachycení bílkovin. Každá protilátka má specifickou fluorescenci [27].
Cytokinové arraye umožňují použít malé objemy vzorku k detekci celé sady cytokinů současně [28-32], a to několika způsoby.
Především je používáno simultánní měření více cytokinů v jedné jamce mikrotitrační destičky. Assay využívá průtokový cytometr, který díky použití laseru, optice a proudící kapalině vykazuje vysokou senzitivitu a rychlost.
• Imunohistochemie
Imunohistochemie (IHC) je běžně používané imunobarvení využívající specifickou vazbu protilátky na antigen v řezu biologické tkáně [33].
Vzhledem k proteinovému charakteru cytokinů lze tuto metodu použít také na jejich detekci. Metoda může být využívána nejen k detekci množství exprimovaného antigenu, ale též k pozorování pozice antigenu.
Klíčem k IHC je výběr primárních a sekundárních protilátek.
I proto jsme se tématu věnovali detailně v článku Jak si vybrat sekundární protilátku.
Zachytit a interpretovat získaný obraz dokážeme prostřednictvím mikroskopie. Mikroskopické snímky mohou být kvantifikovány řadou volně dostupných softwarů např. NIH Image a Image J. Programy umožňují jak pozitivní, tak celkový počet pixelů, což může být vyjádřeno jako poměr měřené intenzity barviva.
Porovnání pěti detekčních metod
| Detekce cytokinů | Výhody | Nevýhody |
| qPCR | Vysoká citlivost
Přímá kvantifikace Reprodukovatelnost Snadné a spolehlivé zpracování dat Umožňuje detekci mnoha různých cytokinů v relativně malého objemu vzorku |
Detekce v relativně malém počtu vzorků
Přítomnost RNA ne vždy reflektuje úroveň proteinu Potřeba odseparovat buňky produkující cytokiny Riziko nedosažení hranice nutné pro detekci |
| ELISA | Přímá
Kvantitativní |
Ne vždy je snadné získat dostatečné množství vzorku
V jednom testu není možné detekovat více cytokinů |
| ELISPOT | Možnost rychlé identifikace a klasifikace buněk produkujících cytokin i při jejich nízkém výskytu | Shodné s metodou ELISA |
| CBA | Malý objem vzorku
Detekce celého cytokinového panelu Rychlejší analýza využitelná pro vysokokapacitní použití |
Vyšší cena
Nízká citlivost |
| IHC | Schopnost identifikovat typy buněk, které produkují cytokiny (tyto buňky nemusí být nalezeny jinými metodami)
Specificita Citlivost Jednoduchá metoda Cena |
Špatná kvantifikace
Nízká citlivost při detekci sekretovaných proteinů |
Samozřejmě existují i další způsoby, jak ověřit výskyt a koncentraci řady cytokinů jako jsou Northern blot, PCR s reverzní transkripcí, hybridizace buněk nebo tkání in situ, nebo Western Blot.
Tento článek popisuje pět metod pro detekci cytokinů v kombinaci s charakteristikami a funkcemi cytokinů. Každá metoda má své výhody, ale nevyhnutelně i své nevýhody. Pokud tedy chcete přesně měřit cytokin ve vzorku, můžete kombinovat dvě nebo více metod, protože je lze vzájemně kompenzovat.
V praktických aplikacích lze metodu vybrat podle jejich příslušných experimentálních účelů a laboratorních podmínek. Ale bez ohledu na to, jakou metodu zvažujete k měření použít, je volba založena na charakteristikách zájmového cytokinu.
O rozdílech mezi metodami ELISA, Multiplex array, Western blot a RIA pojednává náš nedávný článek, který vám usnadní rozhodování, která metoda je „ta pravá.“
Multiplexové stanovení může využívat i technologie, které nevyužívají kuličky. Vzhledem k tomu, že se jedná o náročnou metodu na správné zpracování vzorku, připravili jsme pro vás službu multiplexového stanovení cytokinů a jiných faktorů.
Jejím využitím získáte kompletní servis, včetně rychlých a spolehlivých výsledků, bez nutnosti zavádět nové metody.
(Převzato od společnosti CUSABIO, redakčně upraveno.)
Reference
[1] Alick Isaacs, Jean Lindenmann. Virus interference. I. The interferon [J]. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 1957, 147 (927): 258–67.
[2] Finter NB, Chapman S, et al. The use of interferon-alpha in virus infections [J]. Drugs. 1991, 42(5): 749-65.
[3] Oppenheim, JJ Cytokines: past, present, and future [J]. Int. J. Hematol. 2001, 74:3-8.
[4] Dinarello CA. Proinflammatory cytokines [J]. Chest. 2000, 118: 503–8.
[5] Balkwill F, Charles KA, et al. Smoldering and polarized inflammation in the initiation and promotion of malignant disease [J]. Cancer Cell. 2005, 7:211–217.
[6] Eichten A, Coussens LM, et al. Paradoxical roles of the immune system during cancer development [J]. Nat Rev Cancer. 2006, 6:24–37.
[7] Bienvenu J, Monneret G, et al. The clinical usefulness of the measurement of cytokines. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 2000; 38: 267–85.
[8] Woodman RC, Erickson RW, et al. Prolonged recombinant interferon-gamma therapy in chronic granulomatous disease: evidence against enhanced neutrophil oxidase activity [J]. Blood. 1992, 79 (6): 1558–62.
[9] Key LL, Rodriguiz RM, et al. Long-term treatment of osteopetrosis with recombinant human interferon gamma [J]. N. Engl. J. Med. 1995, 332 (24): 1594–9.
[10] Finter NB, Chapman S, et al. The use of interferon-alpha in virus infections [J]. Drugs. 1991, 42 (5): 749-65.
[11] Hoofnagle JH, Seeff LB. Peginterferon and ribavirin for chronic hepatitis C [J]. N Engl J Med. 2006, 355: 2444–51.
[12] Denuas L, Alcantud V, et al. Use of interferon-alpha in laryngeal papillomatosis: eight years of a Cuban national programme [J]. J Laryngol Otol. 1997, 111: 134–40.
[13] Jacobs L, O’Malley J, et al. Intrathecal interferon in multiple sclerosis [J]. Arch Neurol. 1982, 39:609–15.
[14] Rosenberg SA, JC Yang, et al. Treatment of 283 consecutive patients with metastatic melanoma or renal cell cancer using high-dose bolus interleukin 2 [J]. JAMA. 1994, 271: 907–913.
[15] Rosenberg SA, JC Yang, et al. Durability of complete responses in patients with metastatic cancer treated with high-dose interleukin-2: identification of the antigens mediating response [J]. Ann. Surg. 1998, 228: 307–319.
[16] Yang JC, RM Sherry, et al. Randomized study of high-dose and low-dose interleukin-2 in patients with metastatic renal cancer [J]. J. Clin. Oncol. 2003, 21: 3127–3132.
[17] Marcus JS, Anderson WF, et al. Microfluidic Single-Cell mRNA Isolation and Analysis [J]. Anal Chem. 2006, 78:3084–9.
[18] Marcus JS, Anderson WF, et al. Parallel Picoliter RT-PCR Assays Using Microfluidics [J]. Anal Chem. 2006;78:956–8.
[19] Diercks A, Kostner H, et al. Resolving cell population heterogeneity: real-time PCR for simultaneous multiplexed gene detection in multiple single-cell samples [J]. PLoS One. 2009, 4 No pp. given.
[20] Bustin SA. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays [J]. J Mol Endocrinol. 2000, 25:169-193.
[21] Allan SM, Harrison DC, et al. Selective increases in cytokine expression in the rat brain in response to striatal injection of a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate and interleukin-1 [J]. Molecul Brain Res. 2001, 93:180-189.
[22] Favre N, Bordmann G, et al. Comparison of cytokine measurements using ELISA, ELISPOT and semi-quantitative RT-PCR [J]. J Immunol Methods. 1997, 204: 57–66.
[23] Ekerfelt C, Ernerudh J, et al. Detection of spontaneous and antigen-induced human interleukin-4 responses in vitro: comparison of ELISPOT, a novel ELISA and real-time RT-PCR [J]. J Immunol Methods. 2002, 260: 55–67.
[24] Atochina O, Mylvaganam R, et al. Comparison of results using the gel microdrop cytokine secretion assay with ELISPOT and intracellular cytokine staining assay [J]. Cytokine. 2004, 27:120–8.
[25] Kalyuzhny AE. Methods in Molecular Biology. Totowa, NJ: Humana Press; 2012. Handbook of ELISPOT: Methods and Protocols.
[26] Strand, Nacka. Find 1 cell in 100,000 with ELISpot. MABTECH. Retrieved 6 December 2018.
[27] Elshal MF and McCoy JP. Multiplex Bead Array Assays: Performance Evaluation and Comparison of Sensitivity to ELISA [J]. Methods. 2006, 38: 317–23.
[28] Carson RT, Vignali DAA. Simultaneous quantitation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay [J]. J Immunol Methods. 1999, 227:41–52.
[29] Earley MC, Vogt RF, et al. Report from a workshop on multianalyte microsphere assays [J]. Cytometry. 2002, 50:239–42.
[30] Vignali DA. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J Immunol Methods[J]. 2000, 243:243–55.
[31] Khan SS, Smith MS, et al. Multiplex bead array for detection of soluble cytokines: comparisons of sensitivity and quantitative values among kits from multiple manufacturers [J]. Cytometry, Part B. 2004, 61B: 35–9.
[32] Morgan E, Varro R, et al. Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology [J]. Clin Immunol. 2004, 110: 252–66.