Exozomy – často kladené otázky

Výzkum exozomů

Exozomy jsou malé lipidové nanočástice pocházejících z endozomů (průměr 30-120 nm), které jsou ve většině živých buněk aktivně vylučovány exocytózou. Exozomové uvolňování se objevuje buď konstitutivně, nebo po indukci, a to jak za normálních, tak patologických podmínek, dynamickým, regulovaným a funkčně relevantním způsobem. Exozomy byly izolovány z různých buněčných linií (hematopoetické buňky, nádorové linie, primární kultury a buňky infikované virem), stejně jako z biologických tekutin, zejména z krve (např. sérum a plazma od pacientů s rakovinou) a dalších tělesných tekutin (broncho alveolární výplachová tekutina, pleurální výpotky, synoviální tekutina, moč, plodová tekutina, sperma, sliny apod). Exozomy mají pleiotropní fyziologické a patologické funkce a hrají významnou roli v různých patologických stavech, jako je rakovina, infekční a neurodegenerativní onemocnění.

Pro výzkum exozomů máme k dispozici tyto produkty:

• Protilátky
• Kity pro kvantifikaci
• Nástroje pro izolaci
• Kity pro extrakci exozomální RNA/DNA
• Standardy exozomů
• Fluorescenční standardy exozomů

Často kladené otázky:

1. Co jsou exozomy?

Exozomy jsou extracelulární lipidické nanovesikly , o průměru 30-120 nm, které jsou vylučovány různými buňkami a které se nacházejí ve všech tělních tekutinách, jako je plazma, moč, sérum, sliny a mozkomíšní mok (CSF).

2. Jaký je rozdíl mezi exozomy a mikrovesikly?

Exozomy mají menší průměr než mikrovesikly (30-120 nm vs. 100-1000 nm). Mají různé markery proteinů a hrají různé role v buněčné komunikaci a genetické výměně.

3. Jaké produkty pro izolaci exozomů BioVision nabízí?

Pro izolaci exozomů je v nabídce celá řada produktů. Podrobnější informace najdete na odkazu níže:

http://www.biovision.com/exosome-research-3034/exosome-isolation-tools-3039/

4. Jaký je princip izolace exozomů u těchto produktů?

BioVision nabízí produkty využívající chemického srážení na bázi polymeru (ExoPure^TM Reagent), vylučovací chromatografii (ExoPure^TM SEC Columns), imuno-zachycení (ExoPure^TM Immunoplates, Immunobeads) a izolační nástroje založené na filtraci (ExoPure^TM Isolation kits).

5. Mohou být exozomy izolované pomocí ExoPure^TM Reagent pozorovatelné pouhým okem?

Exozomy jsou malé lipidické nanočástice, které nejsou pozorovatelné pouhým okem. Po izolačním kroku můžete vidět pelety exozomů.

6. Jak jste izolovali plazmatické exozomy?

BioVision má různé metody pro izolaci plazmatických exozomů, jako je ExoPure^TM Reagent, ExoPure^TM SEC Columns, ExoPure^TM Immunoplates, ExoPure^TM Immunobeads) a ExoPure^TM Isolation kits.

7. Jak se ujistím, že jsou exozomy úspěšně izolovány?

Můžete provést Western blot izolovaných, přečištěných exozomů pomocí protilátek proti exozomálním markerům. Pouze resuspendujte vyčištěné exozomy v proteinovém vzorkovém pufru (bez DTT nebo β-merkaptoetanolu) a pak nechte prokázat protilátky proti exozomálním markerům, jako je Alix1 protein, CD9, CD81 nebo CD63. Navíc můžete provádět nano tracking analýzu (NTA) izolovaných exozomů.

8. Jaký biomarker/y používáte k identifikaci/charakterizaci izolovaných exozomů?

Pro charakterizaci izolovaných exozomů používáme kombinaci exozomálních markerů, jako jsou CD9, CD63, CD81, flotillin, Alix1 a TSG101 atd.

9. Existuje nějaký specifický marker pro exozomy izolované z adipocytů?

Ukázalo se, že téměř všechny exozomy odvozené od adipocytů exprimují  fatty acid binding protein (FABP4).

10. Proč je specifická izolace exozomů důležitá?

Máte-li zájem o selektivní a specifické exozomové markery exprimující exozomy, pak doporučujeme metody imuno-zachycení exozomů, tj. použití immunobeads nebo immunoplates. Stejný exozom však může exprimovat více než jeden exozomální marker.

11. Máte činidla pro izolaci exozomů ze Stem Cell média?

Ano, máme izolační soupravu pro izolaci exozomů z média kmenových buněk (Kat.č. K1239-2, -10)

12. Jaké jsou výhody izolačních nástrojů BioVision v porovnání s ultracentrifugací?

• ready to use, snadný a rychlý protokol
• úspora času a financí
• můžete zpracovávat více vzorků najednou
• malý objem vzorku

13. Produktový list uvádí počáteční objem vzorku až 100 µl. Máte nějaké informace o tom, kolik proteinů nebo RNA to znamená? Testovali jste také nižší nebo vyšší objemy vzorků?

100 µl je nejlepší objem tekutin, který se dá použít na ELISA destičky. 200 µl vzorku podstatně nemění výtěžek vesikul, ale zvyšuje pozadí. Nižší objem 50 µl zase snižuje signál při ELISA testu. Výtěžek RNA: je možné izolovat RNA z vesikulů zachycených na immunodestičkách. Vzhledem k tomu, že množství vesikulů v každé jamce je nízké, doporučujeme sběr lyzátů vesikulů alespoň ze 4 jamek, aby se dosáhlo konzistentní výtěžnosti RNA.

14. Pokusili jste se eluovat neporušené exozomy z ELISA destičky?

Neposkytujeme žádné nástroje pro eluci exozomů z ELISA destičky. Zákazník může vyzkoušet následující pufr (glycin 10 mM, Triton 0,05%, pH 2,5). Vzhledem k nízkému výtěžku vesikulů v každé jamce, doporučujeme shromáždit eluované vesikuly z alespoň 4 jamek, aby bylo možné pokračovat v dalších analýzách. Ale nedokážeme s jistotou říci, jestli tato metoda funguje. Při použití immunobeads můžete exozomy vyčistit a eluovat.

15. Jak izolujete a kvantifikujete exozomy v jednom kroku?

Pomocí BioVision’s ExoQuant^TM ELISA kitu můžete provádět kvantitativní a kvalitativní analýzu exozomů malého množství lidských biologických tekutin (plazma, sérum, moč, sliny) nebo buněčných médií. V závislosti na detekčním přístupu (kolorimetrický a luminometrický) si vyberete transparentní nebo bílé destičky.

16. Jaké jsou další metody kvantifikace exozomů?

U jiných než ExoQuant^TM ELISA a ExoQuant^TM FACS kitů může být použita elektronová mikroskopie (dle velikosti částic tak lze odlišit exozomy a jiné visikuly), Nanosight (optický mikroskopický přístup pro kvantifikaci malých částic jako exozomů) a qPCR analýza pro snRNA U6, snoRNA U38B a snoRNA U43 (kvantifikace založená na RNA).

17. Jaký je minimální objem počátečního vzorku, který lze použít pro izolaci exozomů?

Produktový list uvádí až 100 µl počátečního objemu vzorku. Množství exosomů se může mezi jednotlivými vzorky lišit. Proto vždy doporučujeme větší počáteční množství vzorku, zejména pro vzorky moči a buněčných supernatantů. U moči a buněčných médií doporučujeme začít s nejméně 1 ml objemu vzorku. Zkoncentrujte tyto vzorky pomocí centrifugy 10-20x. Pak přeneste 50-100 µl do jedné jamky ELISA destičky. U dalších tělních tekutin je minimální objem 50-100 µl na jamku. Doporučujeme přidat 1x PBS, pokud je objem menší než 100 µl.

18. Jak vyčistit exozomy od vzorků tkáně?

Vzhledem k tomu, že exozomy jsou vylučovány, doporučujeme k izolaci exozomů z tkání provést krátkodobou kultivaci tkáňových explantátů. Kultivované tkáňové explantáty vylučují exozomy. Můžete tedy sbírat buněčný supernatant a izolovat exozomy pomocí protokolu podobného protokolu izolace exozomů z buněčného média.

19. Mohu zmrazit vyčištěné exozomy po izolaci? Ovlivňuje zmrazení exozomovou strukturu?

V ideálním případě by měly být exozomy zpracovány čerstvě. Čerstvé vzorky jsou vždy preferovány oproti zmrazeným vzorkům. Mohou se však použít i zmrazené vzorky o teplotě -80 °C, za předpokladu, že byly zmrazeny ihned po izolaci a nebyly vícekrát rozmrazeny. Exozomální membrána se liší od buněčné membrány, protože pochází z endozomální membrány a je bohatá na fosfolipidy, sfingolipidy, ceramidy a tetraspaninové proteiny, jako jsou CD63, CD81 a CD9, které posilují stabilitu membrány. Cykly zmrazení a rozmrazení však mohou ovlivnit studie morfologie a stanovení velikosti, včetně dynamického rozptylu světla (DLS), nano tracking analýzy (NTA), biologických testů a elektronové mikroskopie (EM).

20. Je nutné pro studium exozomů používat DMSO ve vzorku séra?

DMSO je kryoprotektant používaný k ochraně buněčné membrány před jakýmkoliv poškozením, které může být způsobeno např. tvorbou krystalů. Velikost exozomů a obsah kapaliny v nich je ve srovnání s buňkami velmi malý. Proto nedoporučujeme přidávat DMSO pro mrazení vzorků séra při -80 °C.

21. Jak zjistit obsah bílkovin v exozomech?

Koncentrace bílkovin v exozomech může být detekována Bradfordovými nebo BCA metodami po lýze exozomů. Tím získáte koncentraci proteinů v exozomech v µg/µl.

22. Existuje nějaký specifický marker exozomů?

V současné době ne. Doporučujeme použít několik exozomálních markerů včetně CD9, CD81 a CD63.

23. Jak připravit vzorky exozomů pro Western blot analýzu?

Pro exozomové proteiny doporučujeme použít neredukující pufry. Proto by neměl být při vaření vzorků před nanesením na PAGE použit DTT nebo beta-merkaptoetanol. Detekující protilátky pro Western blot zaměřené na tetraspaniny preferují neredukující podmínky.

24. Existuje nějaký specifický marker pro apoptická tělíska a exozomy pocházející ze stejných buněk?

Annexin V, trombospondin a C3b jsou typickými markery apoptotických tělísek a mohou být použity pro jejich odlišení od exozomů.

25. Jak izolujete exozomální RNA?

Nabízíme ExoRNA^TM Exosome RNA extraction kits pro obecné imunozachycení a extrakci RNA, stejně jako pro zachycení exozomů a extrakci RNA exozomů odvozených od tumorů (kat. č. K1220-K1221).

26. Mohu získat dostatečné množství exosomální RNA z 10 ml supernatantu buněčné kultury pro qPCR?

Výtěžek exozomů závisí na konfluenci buněk, druhu buněk, stavu buněk a době sklizně. Pomocí nástrojů ExoPure^TM lze jednou vyčistit dostatečné množství RNA pro qPCR analýzu.

27. Jaká je negativní kontrola izolace exozomů?

Níže uvedené proteiny by neměly být přítomny:

http://www.journalofextracellµlarvesicles.net/index.php/jev/article/view/26913

Endoplazmatické retikulum; Grp94HSP90B1; Calnexin (CANX); Golgi (GM130); Mitochondrie (cytochrom CCYC1); Nukleus (histonesHIST*H*); komplex Argonaute/RISC (AGO*).

28. Jak připravujete vzorky pro studium exozomů v buněčném médiu?

Buňky inkubujte v FBS ochuzeném o exozomy, nebo v neúplném médiu (bez FBS) při 70-80% konfluenci po dobu 24 hodin před sběrem buněčného média. Potom postupujte podle pokynů uvedených v jednotlivých produktových listech každého produktu.

29. BioVision nabízí dvě různé velikosti immunobeads – 0,4 a 1,0 µm. Jak vybrat velikost pro izolaci z jednoho druhu vzorku – například z biologických tekutin?

Ano, nabízíme dvě různé velikosti Immunobeads. Je-li objem vzorku malý, doporučujeme použít 0,4 µm. Je to proto, že přidané kuličky (beads) zvýší objem vzorku a celkový povrch 0,4 µm je větší než v případě 1,0 µm. Pro malý objem vzorku se tedy více hodí menší kuličky a naopak. Velikost kuliček je také důležitá zejména u exozomů přítomných v malém množství ve velkém objemu vzorku. Větší kulička účinněji zachytí vzácně se vyskytující exozom ve velkém objemu vzorku.

30. Kvantifikace exozomů pomocí standardních nástrojů FACS není možná kvůli malé velikosti exozomů: Jak funguje váš kvantifikační systém ExoQuant^TM FACS?

Po exozomové izolaci jsou purifikované exozomy navázány na 4 µm latexové perličky aldehydového sulfátu (FACS-Beads), následované charakterizací exozomových markerů pomocí FACS analýzy s použitím protilátek specifických na exozomy.

31. Charakterizace exozomů pomocí ELISA může být zaměřena na externí proteinové epitopy na vezikule. Jaká je citlivost testů ELISA a jak rozpoznáte vnitřní proteiny?

Sady ExoQuant^TM ELISA jsou dvojité sendvičové ELISA kity, které se skládají z ELISA destiček předem potažených vlastním exozomovým tetraspaninovými protilátkami, čímž je umožněno specifické zachycení vnějších epitopů za použití různých biologických vzorků. Detekční limit ELISA testu je nižší než 0,35 µg celkového exozomu, což je ekvivalent méně než 50 µg cíleného exozomového proteinu. Kromě toho může být detekce vnějších epitopů provedena analýzou FACS. U interních proteinů doporučujeme Western blot analýzu. Můžete také detekovat interní bílkoviny pomocí FACS analýzy poté, co permeabilizujete exozomy.

32. Co jsou plazmatické exozomové standardy?

Plazmatické exozomové standardy jsou vyčištěné lyofilizované exozomy izolované z poolu zdravých certifikovaných dárců diferenciální ultracentrifugací a mikrofiltrací.

33. Pro izolaci exozomů z buněčného média (s použitím immunobeads) se doporučuje použít koncentrační centrifugaci pro zakoncentrování buněčného média z 10 ml na 1 ml. Máte nějaké doporučení jaké odstředění použít?

Můžete použít centifugační kolonky s cut off 3K a 10k.

34. Které protilátky používáte pro destičky na izolaci neutrálních exozomů?

Název protilátky bohužel nemůžeme odhalit. Vybrali jsme marker neuroblastomu, který je dobře exprimován na povrchu vezikuly, který byl schopen vázat vezikuly v ELISA destičce a je užitečný pro obohacení exozomů nervového původu, fyziologicky produkovaných ze zdravých buněk v těle.

35. Charakterizujete obsah DNA/RNA u lyofilizovaných standardů exozomů?

Při výrobě nové exozomové standardní dávky, nukleové kyseliny netestujeme. V minulosti jsme však provedli mnoho testů. Ve skutečnosti se používají jako pozitivní kontrola v soupravě RNA pro izolaci exozomové RNA. Lyofilizované standardy se v současné době používají jako pozitivní kontrola v soupravě RNA a DNA, takže je lze použít k izolaci nukleových kyselin.

36. Můžeme detekovat DNA ve standardech exozomů?

Vezikuly obvykle obsahují velmi malé množství DNA, z nichž většina je fragmentovaná a jednovláknová a množství není dostatečné pro analýzu v agarózovém gelu. Souprava ExoDNA^TM kit může být použita pro analýzu genových mutací nesených vezikuly nebo cirkulujících v tělních tekutinách pomocí qPCR.

37. Existuje nějaká možnost kontaminace genomovou nebo mitochondriální DNA pomocí ExoDNA^TM Extraction kit?

Extrakční soupravy ExoDNA^TM umožňují izolaci cirkulující DNA+s extracelulárními vezikuly (EV)-asociovanou DNA a genomovou DNA obsaženou v EV. Výskyt určitého množství mitochondriální DNA v EV je též možný, ale důkazy o této problematice ještě zcela nejsou. Pokud zákazníci chtějí omezit svou analýzu pouze na DNA obsaženou v EV, mohou po vysrážení vezikulů+cirkulující DNA provést ošetření DNasou ještě před přidáním lyzačního pufru, DNasou tak eliminují pouze frakci cirkulující DNA.

38. Existuje nějaká možnost kontaminace ribosomální RNA použitím ExoDNA^TM Extrakčních kitů?

Ano, možnost kontaminace RNA existuje, protože vezikuly obsahují RNA, zejména miRNA. Procentuální podíl ribozomální RNA ve vezikulech je však malý.

39. Využívá ExoDNA^TM Extraction kit ošetření RNasou?

Ne, extrakční kity ExoDNA^TM  nepřijímají žádné oštření RNasou, ale je možné provádět ošetření RNAsou po vymytí DNA.

40. BioVision FACS využívají protilátky CD9 nebo CD63. Jsou tyto protilátky FITC konjugované nebo na jaké barvivo jsou protilátky konjugovány?

V testovacích sadách BioVision FACS^TM nejsou protilátky konjugovány. Poskytujeme sekundární protilátku Alex 488 (součástí soupravy).

41. Sráží exozomová izolační činidla apoptotická tělíska?

Apoptotická tělíska jsou mnohem větší (> 800 nm), tudíž k jejich odstranění ze vzorku dojde během odstřeďování (spolu s buňkami a nečistotami). Exozomová reakční činidla se přidávají v následujícím kroku a vysráží primárně exozomy (30-120 nm).

42. Jaké je složení pufru, v němž bude konečný preparát exozomů? Bude mít dopad na navazující testy?

Vyčištěná peleta exozomu je suspendována v PBS, což je kompatibilní s většinou návazných testů, včetně extrakce RNA/proteinů, QRT PCR, TEM test, Western blotting, značení povrchu atd.

43. Mohu použít heparin nebo EDTA zkumavku ke sběru vzorku krve, pokud potřebuji izolaci exozomu z plazmy?

Ne. Heparin významně zhorší následné RNA stanovení. EDTA může interferovat s následným PCR testem. Použijte zkumavky bez heparinu a EDTA, vzorek okamžitě odstřeďte, aby se zachytila plazma pro izolaci exozomů. Pokud májí být použita antikoagulancia, použijte EDTA zkumavku. Pokud je to nutné, upravte koncentraci Mg²⁺ v následné PCR reakci.

44. Můžeme blokovat/inhibovat uvolňování exozomů z rakovinných buněk?

Dimethyl amelorid (DMA), spingomyelinazový inhibitor (GW4869) a inhibitor glukosylceramid syntázy (dithreo-1-1-fenyl-2-dekanoylamino-3-morfolino-1-propanol) inhibují uvolňování exozomů z různých buněčných linií. Alternativně shRNA sražená na Rab27 nebo Rab35 by byla ideálním kandidátem pro inhibici uvolňování exozomů.

45. Můžete doporučit izolaci miRNA a RTs kit pro qPCR analýzu?

Nabízíme ExoRNA^TM Exosome RNA extraction kit. Sada obsahuje imunobeads pro celkové zachycení exozomů, všechny roztoky, kolony a eluční zkumavky pro extrakci RNA. Tato sada umožňuje vysoký výtěžek veškeré extrahované RNA včetně malých RNA, miRNA.

46. Proč jsou hladiny exozomální miRNA vyšší v plazmě ve srovnání se sérovou exozomální miRNA?

Je možné, že během odstranění sraženiny z celé krve během přípravy sérového vzorku ztrácíte exozomy a tím i exozomální miRNA. V případě plasmy je menší pravděpodobnost ztráty vezikulů a tím i exozomální miRNA.

47. Jsou exosomy ovlivněné buněčnou smrtí? Má buněčná smrt na exosomy vliv?

Ano, buněčná smrt rozhodně ovlivňuje vylučování exozomů. Proto vždy pro studium exozomů doporučujeme zdravé a životaschopné buňky. Navíc apoptotické buňky uvolňují mnoho apoptotických vezikul.

48. Jaký by měl být výnos exozomů na buňku?

Výnosy exozomů na buňku nebo na celkový počet mohou záviset na několika faktorech, včetně typu buňky, konfluence buněk, podmínek kultury (růstových faktorů atd.), času sklizně, jednotnosti ve velikosti exozomů a typu zdroje. Tím pádem nelze určit počet exozomových výtěžků na buňku.

49. Mohu vizualizovat apoptotická tělíska, mikrovesikuly a pelety exozomů po odstředění?

Po odstředění nelze rozlišovat pelety exozomů od pelet apoptotických tělísek. Chcete-li charakterizovat jednotlivé extracelulární vezikuly, můžete použít western blot (WB), průtokovou cytometrii (FACS), globální proteomickou analýzu včetně hmostnostní spektrometrie nebo elektronové mikroskopie a mikroskopie atomárních sil pro charakterizaci jednotlivých extracelulárních vezikulů. U větších vezikulů včetně apoptotických tělísek lze použít cytospinové a imunofluorescenční obrazy a pro distribuci velikosti lze použít Nanosight analýzu a dynamickou Light Scattering analýzu.

50. Jaké jsou skladovací podmínky upraveného média pro následnou izolaci exozomů?

Doporučujeme vzorky ihned zpracovat. Buněčná média však mohou být uchovávána při teplotě 4 °C po dobu až jednoho týdne bez zásadních změn. Pro dlouhodobé skladování doporučujeme skladovat při -80 °C.

51. Jaké množství RNA mám očekávat v sérových exozomech?

Většina exozomů obsahuje velmi malé množství nukleových kyselin. Koncentrace RNA ve vzorcích séra je příliš nízká, aby mohla být pozorována v agarózovém gelu nebo dokonce nanodropem. Pro kontrolu koncentrace RNA můžete vyzkoušet RNA Pico Agilent Bioanalyzer chip.

52. Je exozom vylučován klidovými buňkami?

Exozomy se vytvářejí jak během recyklace plazmatické membrány, tak během intercelulární komunikace, tudíž lze říci, že exozomy jsou vylučovány i klidovými buňkami.

53. Jak mohu normalizovat expresi mRNA v exozomech?

Můžete použít geny miRNA, jako je miRNA16, miRNA26a, miRNA221, miRNA22, miRNA181a, miRNA181c, miRNA103, miRNA191, let7d a malé RNA (5SrRNA a U6snRNA), které jsou normálně v exozomech exprimovány.

54. Jak mohu exozomy po izolaci zafixovat pro mikroskopii?

Exozomy jsou tak malé, že je obtížené dosáhnout navázání dostatečného množství protilátky pro detekci pomocí imunofluorescence. Můžete použít transmisní elektronovou mikroskopii.

55. Kterou protilátkou jsou potaženy immunobeads? Zůstávají na povrchu exozomů nějaké molekuly poté, co jsou exosomy vymyty z kuliček? Pokud ano, jak ovlivňují chemické skupiny na povrchu exosomů následné experimenty?

Pro potahování immunobeads jsme použili mnoho různých protilátek na základě toho, z jakého vzorku jsou exozomy izolovány. Například, pokud chcete izolovat exozomy z biologických tekutin (sérum, plazma, moč), jsou immunobeads potaženy CD9 a CD63. Protilátky z immunobeads se váží na antigen na povrchu exozomu, takže nedochází k chemické modifikaci. Použitím elučního pufru se exozomy uvolní z immunobeads a vyčištěné exozomy mohou být použity pro jakýkoli následný experiment.

56. Proč se používají immunobeads a ne ExoPure^TM činidlo v Exosome Immunocapture and RNA Extraction kit in BV – kat.č. K1220? Zachytí immunobeads všechny exozomy ve vzorku?

V RNA Extraction kit (kat.č.K1220) jsme použili immunobeads pro zachycení celkové populace exozomů ze široké škály vzorků včetně supernatantů buněčných kultur a lidských biologických tekutin (plazma, sérum, moč, atd.), stejně jako pro obohacení některých specifických subpopulací exozomů (exozomy odvozené od nádorů). Avšak vzhledem k tomu, že tato metoda je založena na imunozachycení, nebude schopna zachytit všechny exozomy, které neexprimují odpovídající marker. Pokud chcete, můžete v prvním kroku použít činidlo ExoPure^TM (namísto izolace založené na imunozachycení). Poté použijte lyzační pufr a spin kolony (poskytnuté v rámci RNA kitu, kat.č. K1222) pro izolaci RNA.

57. Pokud použijeme ExoPure^TM Isolation reagent, bude reagencie interferovat s následnými experimenty po extrakci exozomové RNA?

Izolační činidlo ExoPure^TM izoluje exozomy v jednom kroku z malého objemu vzorku. Ano, můžete použít izolační činidlo a následně extrahovat RNA z vyčištěných exozomů. Izolační činidlo nebude interferovat s následnými experimenty extrakce RNA. Nicméně, my doporučujeme použití více specifické metody imunozachycení pro izolaci exozomů před purifikací RNA. Dále, pokud používáte izolační činidlo ExoPure^TM pro čištění exozomů, doporučujeme odmytí izolačního činidla před krokem extrakce RNA (kat.č. K1222).

58. Kolik RNA by mohlo být extrahováno za použití imunozachycení a pomocí RNA Extraction Kit?

Jak je uvedeno v datovém listě pro produkt K1222, porovnali jsme kvalitu exozomové RNA po exozomové izolaci a extrakci RNA s konkurencí. Garantujeme uvedenou kvalitu a výnosnost metody.

59. Kolik exozomů by bylo detekováno v každé testovací jamce exozomálního ELISA kitu? Jaká je citlivost soupravy pro vzorky buněčných médií?

Citlivost testu ExoQuant^TM ELISA kit (kat.č. K1205, kolorimetrický) je přibližně 39 µg bílkovinného ekvivalentu. V datovém listě je ukázáno, že 10 µg lyofilizovaných exozomů odpovídá 0,1 ng rekombinantního exozomálního proteinu. Vzhledem k tomu, že nižší koncentrace ve standardních křivkách je 0,39 µg lyofilizovaných exozomů, citlivost našeho testu je tudíž okolo 39 µg bílkovinného ekvivalentu. Počet exozomů ve vzorku závisí také na typu vzorku, podmínkách buněčné kultivace, typu ošetření, chorobných stavech apod.

60. Je možné nahradit krok centrifugace (30 min/10000 g) jinou metodou, pokud zákazník nemá odstředivku s tak vysokou odstředivou silou?

Ano, centrifugovat je možné při 6000 g po dobu nejméně 1 hodiny.

61. Máte produkty pro studie sledování extracelulárních vesikulů (EV)?

Biovision nabízí vysoce purifikované fluorescenční exozomové standardy pro tyto studie. Exozomy jsou značeny zeleným barvivem, které poskytuje stabilní fluorescenční dlouhodobě dobře viditelný signál. Fluorescenční exozomy jsou dostupné pro lidské biologické tekutiny a kultivační média.