Počítání buněk je únavná práce, kterou je potřeba dělat řádně, ať už v průmyslu nebo na akademické půdě, ať už ručně nebo automatizovaně. Ve všech případech potřebujete obdržet důvěryhodné výsledky, abyste mohli dále pokračovat ve své práci.
Abychom vám v tomto pomohli, máme pro vás několik tipů, které vám mají pomoci k rychlejšímu počítání a k získání lepších experimentálních výsledků. I přes letité zkušenosti s ručním počítáním vás některé tipy možná překvapí.
Tip č. 1: Přípravu vzorku v žádném případě nepodceňujte
Ať už se rozhodnete stanovovat buněčnou koncentraci manuálně či automaticky, pro získání přesné hodnoty je potřeba správná příprava vzorku. Nekvalitně připravený vzorek je jednou z hlavních příčin špatného počítání. Co můžete v rámci prevence nesprávné analýzy vzorku udělat? S použitím následujících 3 kroků je možné získat přesnější výsledek, a také dosáhnout menších rozdílů mezi vícero pracovníky.
• Standardizujte své protokoly
Každý pracovník má svůj vlastní způsob, jak počítat buňky – trypsinizací buněk počínaje a způsobem pipetování konče. Standardizací protokolů v celé laboratoři/instituci a ujištěním se o jejich dodržování můžete zvýšit přesnost počítání mezi jednotlivými vzorky.
Přivést každého k dodržování protokolu může stát někdy určité úsilí a čas, nicméně z dlouhodobého hlediska je výsledkem přesnější počítání, které vede k lepším výsledkům experimentů a v konečném důsledku k šetření financí.
• Udržujte homogenní suspenzi
Při analýze vzorku se předpokládá, že distribuce buněk ve vzorku je reprezentativní pro celou suspenzi. Je však známo, že když buněčná suspenze chvíli stojí, klesají buňky vlivem gravitace ke dnu zkumavky. Následkem je koncentrační gradient v rámci suspenze, tudíž jakýkoli odebraný vzorek není reprezentativní.
Použitím vortexu nebo poklepem prstu před odběrem vzorku je možné znovu získat homogenní rozdělení. Někteří pracovníci preferují resuspendování buněčné kultury opakovaným nasáváním a vypouštěním vzorku do pipety. Ať už použijete jakýkoliv postup, ujistěte se, že je ve standardním protokolu.
• Odstranění inkluzí rozpadlých buněk
U většiny protokolů počítání je pravděpodobná přítomnost určitého množství rozpadlých buněk. Debrity mohou v případě špatného zaostření způsobit nesprávné zařazení, např. zbytky jsou počítány jako buňky (falešně pozitivní), nebojsou buňky vyloučeny jako debris (falešně negativní).
Minimalizováním množství zbytků obsažených ve vzorku se zlepší přesnost výsledků. V opačném případě lze špatnou klasifikaci snížit tréninkem manuálního počítání nebo zlepšením detekovaných parametrů u automatizovaných systémů, a tím získat přesnější data.
• Závěr
Chcete-li mít lepší vzorek a tím i lepší výsledky, zaměřte se na standardizaci protokolů a řiďte se jimi, jak nejlépe dovedete. Tento krok minimalizuje chyby způsobené přípravou vzorku, ale také variaci výsledků mezi jednotlivými spolupracovníky. Přesnost počítání je možné výrazně zvýšit i udržováním vzorku v homogenním stavu a vyloučením přítomnosti buněčných zbytků.
Tip č. 2: Pochopení celkových nákladů na počítání buněk
Postup pro ruční počítání buněk je jednoduchý: sklidit buňky, rozředit je, aplikovat vzorek na sklíčko hemocytometru, dívat se do mikroskopu a počítat/klikat. Každý, kdo má základní zkušenosti s buněčnou kultivací může tento postup používat. Jedná se o levný způsob, jak získat přesný počet i výsledky. Ale je to nejlevnější způsob?
K provádění manuálního počítání je potřeba již určitou úroveň odborné znalosti. Schopnost rozlišit mezi živými a mrtvými buňkami, shluky a buněčnými zbytky vyžaduje určitý čas a trénink.
Ke zvýšení laboratorní produktivity proto byly představeny automatické buněčné počítačky. Se zlepšenou automatizací však také přichází finanční náklady. Zde je pak na místě otázka, zda je manuální počítání levnější než počítání automatické.
• Která technika počítání je finančně výhodnější?
Ať už je vaše metoda počítání jakákoliv, vždy existují 3 typy nákladů, se kterými je třeba počítat: počáteční pořizovací náklady, provozní náklady (např. spotřební materiál) a náklady na pracovníka.
Manuální počítání je zdaleka nejlevnější variantou při nákupu. Náklady na tento systém sestávají z ceny skleněné počítací komůrky a „klikru“, dohromady v přepočtu za 4300 Kč. Není zde samozřejmě započítán běžný světelný mikroskop, který je standardním laboratorním vybavením. Na spočítání jednoho sklíčka jsou provozní náklady kolem 0,6 Kč. Tedy jedná se o opravdu levné řešení.
Proč by tedy měly být automatické počítačky buněk finančně zajímavé? Situace začíná být zajímavá započítáme-li u manuálního i automatického počítání náklady na pracovníka.
• Časy se mění
Ostřílený pracovník stráví analýzou buněk nejméně čtyři minuty, v porovnání s automatickým řešením, které zabere pouze několik sekund. Toto dramaticky snižuje náklady na operátora, zejména se zvyšujícím se počtem počítaných vzorků.
I se skromnými pořizovacími náklady automatizovaného systému začínajících na 85 000 Kč, může automatická počítačka představovat návratnou investici se zvyšujícím se počtem měření.
Další nárůst nákladů je totiž spojen s provozními náklady, protože automatické řešení často vyžaduje dražší spotřební materiál. Jednorázové pomůcky jsou zhruba 15x dražší v porovnání s použitím sklíčka pro manuální počítání.
Co můžeme vyvodit z výše zmíněných informací? Pokud spočítáme celkové náklady jak na manuální, tak na automatické počítání, zahrneme počáteční pořizovací náklady a náklady na provoz a čas pracovníka, uvidíme bod zlomu, ve kterém je automatické počítání dražší díky vyšším nákladům na spotřební materiál (Obr.1).
Obrázek 1: Představení celkových nákladů na manuální a automatické počítání buněk. V obou případech jsou započítány pořizovací i provozní náklady a náklady na pracovníka. Bodu zlomu je dosaženo u zhruba 2 600 měření.
• Závěr
Pořizovací náklady řešení na počítání buněk jsou důležitým faktorem, pokud srovnáváme jednotlivá řešení. Ale pokud se díváme jen na počáteční náklady, můžeme investovat z dlouhodobého hlediska více.
Když tedy zahrneme veškeré náklady na počítání, uděláme si lepší finanční obrázek u různých přístupů. Doporučuje se proto, abyste si udělali své vlastní porovnání nákladů v závislosti na vaší situaci. Pozice bodu zlomu se tak může při srovnávání automatického a manuálního systému lišit. Někdy se může stát, že nenastane vůbec.
Tip č. 3: Drobnost, která vám pomůže
Postup pro ruční počítání buněk je jednoduchý: sklidit buňky a následně je spočítat. Nicméně tento postup je náchylný k chybám.
Možná jste při prvním pokusu použili špatně nastavenou pipetu a přidali příliš trypsinu. Nebo možná špatný výpočet způsobil, že vám v lahvičce nezbyly skoro žádné buňky. Možná ještě nemáte všechny znalosti pod kůží.
Postupem času je člověk zkušenější a stává se v počítání buněk stále větším odborníkem. Stále je však občas nutná improvizace. Možná někdy dojdou lahvičky T-175 a je nutné sáhnout po T-25, aby bylo možné buňky kultivovat dále. Ale kolik mL je potřeba dát do T-25?
Abychom vám s těmito maličkostmi pomohli, připravili jsme pro vás malou „švindlovací“ tabulku. Tato šablona obsahuje obecné informace o lahvičkách a užitečnou kalkulačku.
Pro stažení šablony klikněte na odkaz ZDE.
Tip č. 4: Osvětlení přesnosti počítaček buněk
Jeden z nejdůležitějších aspektů při nákupu vybavení do výzkumné laboratoře je jeho přesnost. Důležitou otázkou zde je, jakým způsobem přesnost systému stanovujete. A jaký je rozdíl mezi „precizností,“ „pravdivostí“ a „přesností.“ Jedná se o tři termíny, které jsou často zaměňovány, i když mají jiný význam.
Nejprve se podíváme na to, které definice by měly být používány. ISO 5725 používá k popisu přesnosti měření metody dva termíny „pravdivost“ a „preciznost.“
„Pravdivost“ je popisována jako těsnost shody mezi aritmetickým průměrem nekonečného počtu opakovaných naměřených hodnot veličiny a referenční hodnotou veličiny.
„Preciznost“ je popisována jako těsnost shody mezi naměřenými hodnotami veličiny získanými opakovanými měřeními na stejném objektu za specifikovaných podmínek.
Obecný termín „přesnost“ je používán v ISO 5725 a váže se k oběma termínům – pravdivosti a preciznosti. *
Termín přesnost kdysi obsahoval pouze jednu komponentu a to pravdivost, ale řada lidí došla k názoru, že by měl zahrnovat celkové rozvrstvení výsledků od referenční hodnoty stejně tak jako systematický efekt.
Zkreslení termínů bylo ve statistickém hodnocení po velmi dlouhou dobu, protože způsobovalo jisté filozofické námitky napříč členy řady profesí (jako lékaři a právníci). Pozitivním aspektem bylo vymyšlení termínu pravdivosti.
Obecným termínem pro variabilitu mezi jednotlivými opakovanými měřeními je preciznost. Pro popis preciznosti byly nalezeny dva nezbytné termíny, a to ‘opakovatelnost’ a ‘reprodukovatelnost’, které popisují variabilitu měřících metod. Preciznost je vyjadřována termínem ‘standardní odchylka’.
Abychom situaci shrnuli, pouze přístroj, který měří s vysokým stupněm pravdivosti a preciznosti poskytne přesné výsledky.
Obrázek 2: Ukázka rozdílných variant přesnosti s rostoucí pravdivostí a precizností. (A) S vysokou precizností, podhodnocuje nebo nadhodnocuje aktuální vzorek. (B) Systém je přesný pouze s vysokou pravdivostí a precizností. (C) S nízkou mírou pravdivosti a nízkou mírou preciznosti je dosaženo velmi nízké přesnosti. (D) Pokud je vysoká pouze pravdivost, průměrná hodnota je sice správná, ale k měření je potřeba hodně vzorků.
• Jak měřit pravdivost u počítačky buněk
Pravdivost počítačky buněk je popsána jako těsnost vypočítané průměrné hodnoty měření na přístroji a aktuální koncentrace buněk. Abychom toto zjistili, je třeba na zařízení analyzovat vzorek o známé koncentraci.
Je potřeba též vzít do úvahy, že počítačky buněk se mohou chovat rozličně na krajní škále jejich pracovního rozsahu. S touto znalostí může být udělán jednoduchý test s různými ředěními vzorku, čímž vytvoříme kalibrační křivku.
Kalibrační křivka odhalí pravdivost počítačky buněk v rámci celého pracovním rozsahu, ne jen ve specifické koncentraci. Pokud děláte kalibrační křivku, počítačka buněk s vysokou pravdivostí vám ukáže dvě věci:
– lineární závislost mezi měřenou koncentrací a teoretickou koncentrací
– sklon blízký hodnotě 1
• Jak měřit u počítačky buněk preciznost
Nyní, když víme, jak měřit pravdivost si popíšeme, jak měřit u počítačky buněk preciznost. Jak bylo zmíněno dříve, preciznost počítačky buněk definuje, jak je systém robustní. Proto, když počítáte vzorek několikrát po sobě, měli byste získat podobné výsledky.
Statisticky je toto reprezentováno variačním koeficientem (CV value, coefficient of variation) a může být vypočítán s použitím rovnice č. 1., kde σ je směrodatnou odchylkou a x̄ aritmetickým průměrem vašich výsledků.
Rovnice č. 1:
Vypočítaná CV hodnota by vždy měla být srovnatelná s teoretickou hodnotou CV, která by měla být vypočtena s použitím rovnice č. 2. Aby byla determinována preciznost, je teoretická CV hodnota referenční pro změřenou CV hodnotu.
Naměřená CV hodnota by měla být blízká teoretické hodnotě, ale neměla by být nižší. Naměřená CV hodnota bude vyšší, protože zvětšená směrodatná odchylka je závislá na chybě systému a operátora.
Rovnice č. 2:
• Závěr
Ukázali jsme, jak stanovit přesnost počítačky buněk. Přesnost se sestává ze dvou komponent, pravdivosti a preciznosti. Ukázali jsme si, v jakém jsou tyto hodnoty vztahu vzhledem k počítačce. S těmito informacemi si můžete zhodnotit informace, které nám poskytuje výrobce a systém si tak otestovat.
Tip č. 5: Přejděte z manuálního počítání na automatizovaný
Někteří lidé mívají vůči automatickému počítání buněk v porovnání s manuálním počítáním předsudky. Abychom toto téma dobře prozkoumali, musíme si odpovědět na jednu otázku: Co chcete počítat?
Odpověď na tuto otázku bude mít vliv na to, jaký typ počítání bude vyhovovat vašim potřebám. Možná budete měřit pouze jeden buněčný typ několikrát za den nebo zkoumat celou řadu buněk a bakterií. Pokud se rozhodujete mezi manuálním a automatickým počítáním, ať už počítáte cokoliv, měli byste zvážit následující 4 aspekty.
• Náklady
Manuální počítání buněk má nejnižší počáteční pořizovací a provozní náklady díky možnosti recyklace. Především v případě nízkého počtu měřených vzorků se jedná o nejlepší výběr vzhledem k rozpočtu (viz tip č. 2).
Nicméně, takto nejsou zahrnuty náklady na čas, který pracovník počítáním buněk stráví a na čas, který je nezbytný k tomu získat v manuálním počítání praxi. Náklady proto mohou výrazně stoupnout, pokud započítáme veškeré náklady a narůstá počet měření.
Pro automatické počítání mohou počáteční náklady představovat velkou překážku, protože jsou často až 1000x vyšší. Výhodou automatických systémů je, že výrazně snižují čas zpracování vzorku. Dalším nákladem je nezbytnost spotřebního materiálu.
Pokud je zařízení používáno na velké množství měření, může náklad spojený se spotřebním materiálem předčit i počáteční pořizovací náklady. S narůstajícím počtem měření pak náklad na automatický systém klesá oproti manuálnímu počítání díky zkrácení nákladu na čas pracovníka.
• Přesnost
Pro oba systémy, manuální i automatický platí, že obdržené výsledky musí být přesné. Manuální počítání přináší tyto výhody: univerzálnost, přesná klasifikace, detekce problému v raném stádiu jeho výskytu. Vzhledem k tomu, že pracovník buňky přímo pozoruje, může jakoukoli chybu zpozorovat velmi brzy.
Nevýhodou lidského faktoru je, že výsledky jsou subjektivní, a tudíž variace mezi jednotlivými pracovníky může být poměrně vysoká. Protokol pro počítání buněk se může mezi jednotlivými pracovníky lišit, a to i když počítají na stejné komůrce hemocytometru.
Automatické počítání buněk má výhodu nižší chybovosti na počet vzorků a není zatíženo subjektivitou jako je tomu u manuálního počítání. Automatizace přináší ve srovnání s počítáním ručním i vysokou reproducibilitu.
Přestože u automatického počítání není lidský faktor, který by buňky klasifikoval, je u počítaček možnost špatné klasifikace vyšší. Může se tak stát, že ačkoli je počítačka precizní, nemusí být pravdivá, a proto může podhodnotit aktuální koncentraci.
• Univerzálnost
Manuální počítání buněk je jednoduše adaptovatelné na řadu situací, což toto řešení činí opravdu univerzálním. Současně je ale limitováno pracovníkem. K omezení limitů pracovníka je potřeba získat praxi.
Automatické počítačky umožňují vyšší výkonnost, a tudíž i možnost spočítat vyšší počet vzorků. Výsledkem je vyšší produktivita a méně špatných klasifikací v rámci vzorků. Specifika systému však představují limit v jeho všestrannosti.
• Dělání záznamů
Pro manuální počítání se způsob dělání laboratorních záznamů nezměnil od použití prvního hemocytometru v 19. století. Pracovník své výsledky jednoduše zapisuje do laboratorního deníku.
Na straně automatizace se změnilo hodně, což umožňuje dělat reporty z výpočtů podrobněji a rychleji. Nynější systémy přinášejí detailnější reporty z analýz, včetně grafických záznamů počítaných buněk. Ukládání dat na cloudu navíc umožňuje pracovníkovi později data znovu analyzovat, což může přinést nové výsledky, které byly před tím přehlédnuty.
• Závěr
Před rozhodováním se mezi automatickým a manuální počítáním, začněte s určením, které buňky potřebujete počítat. Abyste dobře zvážili, které řešení je pro vás to pravé, je potřeba přesně vědět co a v jakém počtu budete počítat.
Zaměřte se na detaily jak u manuálního, tak automatického systému ve vztahu k nákladům, přesnosti, univerzálnosti, reportování a jak vyhovují vašim požadavkům.
O systému, který splní vaše potřeby se můžete rozhodnout co nejlépe, pokud zvážíte všechny informace. A tak budete buď pokračovat v manuálním počítání nebo možná přejdete na automatizované řešení. (1)
Návrh na CTA: Pokud uvažujete o pořízení automatické počítačky buněk a zajímá vás rozdíl mezi otevřenými a uzavřenými systémy, přečtěte si určitě náš článek o automatizovaných počítačkách.
* Poznámka překladatele: Termíny přesnost, pravdivost a preciznost nepředstavovaly problém pouze v angličtině, ve které byl tento článek originálně napsán. Obdobná situace byla i v České republice, kdy nebylo zřejmé, jak se anglické termíny do českého jazyka překládají.
I závěrečná zpráva z roku 2006 poukazuje na rozdílný překlad v rámci vědních oborů. Zatímco chemie používala tyto významy: accuracy – správnost, precision – přesnost, trueness – pravdivost; statistika používala tato označení: accuracy – přesnost, precision – shodnost/preciznost, trueness – správnost. (2)
Metodický list z roku 2018 nám již předkládá konsensus, ke kterému bylo dospěno při překladu třetího vydání Mezinárodního metrologického slovníku, na kterém se podílela celá řada odborníků. Odtud vychází terminologie použitá pro překlad tohoto článku neboli: accuracy – přesnost, precision – preciznost a trueness – pravdivost. (3)
(Převzato od společnosti Corning, redakčně upraveno.)
• Reference
(1) https://www.corning.com/media/worldwide/cls/documents/applications/CLS-AN-496%20DL.pdf
(2) https://meloun.upce.cz/docs/publication/196zprava.pdf
(3) http://www.eurachem.cz/user-files/files/metodicky-list-2-2018.pdf