Použití systému CRISPR / Cas9 v savčích buňkách se ukázalo jako velmi praktický způsob modifikace buněčného genomu ve specifickém lokusu. Zahrnuje přechodnou transfekci do savčích buněk buď:
(a) jednoho nebo několika plazmidů kódujících Cas9, specifickou gRNA a případně sekvenci, která má být vložena, nebo
(b) směs jednoho nebo dvou plazmidů a molekuly RNA (gRNA).
Podívejte se na Webinář CRISPR-Cas9: přehled, výzvy a nejnovější technologie.
Editace genomu pomocí systému CRISPR / Cas9
Spojení CRISPER (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, segmenty nahromaděných pravidelně rozmístěných krátkých palindromických repetic) a CRISPER asociovaných nukleáz (Cas) je inovativní technologie pro generování genových knockoutů nebo pro zavedení definovaných sekvenčních modifikací nebo delecí v genomu. Systém CRISPR / Cas9 je prokaryotický imunitní mechanismus, který zajišťuje rezistenci vůči cizím genetickým prvkům a sestává z DNA nukleázy zvané Cas9 a nekódující guide RNA (gRNA). gRNA navádí nukleázu Cas9 ke specifickému komplementárnímu lokusu. Nukleáza následně indukuje dvou-řetězcový zlom.
Při použití systému CRISPR / Cas9 je k zajištění úspěšné editace genomu často klíčovým a omezujícím krokem transfekce. Pro transfekci gRNA a expresi proteinu Cas9 existují tři hlavní přístupy. Jedná se o systém vnášení DNA, RNA nebo RNP (protein gRNA + Cas9). Každý systém má své klady a zápory z hlediska jednoduchosti použití, účinnosti úpravy genomu a off-target efektů. Vnesení gRNA a Cas9 ve formě plazmidu je velmi účinný systém pro snadno transfekovatelné buněčné linie, ale není tak vhodný pro obtížně transfekovatelné primární buňky a rakovinné buněčné linie. Dalším parametrem, který je třeba vzít v potaz, je doba, po jakou má být Cas9 v buňkách exprimován, protože může docházet k nespecifické nukleázové aktivitě. Systémy bez přítomnosti DNA, ve kterých je protein Cas9 vnášen jako mRNA nebo ještě lépe, jako protein, mohou zlepšit specifičnost endonukleázové aktivity Cas9.
Citace:
Li, Y. (2016) Exploiting the CRISPR/Cas9 PAM Constraint for Single-Nucleotide Resolution Interventions. PLoS One 11 e0144970
Shi, J. & al. (2015). Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature 526 660-5
D’Osualdo, A. (2015). Transcription Factor ATF4 Induces NLRP1 Inflammasome Expression during Endoplasmic Reticulum Stress. PLoS ONE 10 e0130635
Moore, R., (2015) CRISPR-based self-cleaving mechanism for controllable gene delivery in human cells. Nucleic Acids Res 43 1297-303
Produkty společnosti Polyplus pro editaci genomu prostřednictvím CRISPR/Cas9 systém
Činidlo společnosti Polyplus jetPRIME® je ideální pro in vitro editaci genomu na bázi plasmidové DNA. Vyžaduje malé množství DNA a je vhodné pro vícenásobnou transfekci plasmidu při zachování vynikající životaschopnosti buněk.
Činidlo jetMESSENGER® je ideální pro efektivní kotransfekci mRNA Cas9 a gRNA. S Cas9 mRNA a gRNA lze dosáhnout rychlejší editace genů, protože již není potřeba transport do jádra a není nutná transkripce Cas9. Přechod z transfekce plazmidové DNA na transfekci Cas9 mRNA umožňuje editaci genomu v řadě studií primárních buněk a buněčných linií.
Produkt jetCRISPR™ je nejnovější inovativní činidlo určené k přímému vnesení Cas9 ve formě proteinu společně s gRNA, známé také jako dodávání ribonukleoproteinů (RNP). Jak transkripce, tak translace za účelem získání funkčního proteinu Cas9, je zcela vynechána, což činí vnesení RNP pomocí jetCRISPR™ nejrychlejším, nejúčinnějším a nejpřesnějším způsobem genové editace, který je v současné době k dispozici pro širokou škálu buněk.
Pro editaci genomu in vivo doporučujeme použít činidlo in vivo-JetPEI®. Díky němu dosáhnete vynikajícího přenosu nukleových kyselin do různých orgánů in vivo a to prostřednictvím různých systémů.