ISH
in situ hybridizace (ISH) umožňuje lokalizaci části sekvence nukleové kyseliny v buňkách nebo v tkáních. Základní princip ISH spočívá v detekci nukleové kyseliny hybridizací komplementární sondy, ke které je připojena reportérová molekula – značka[1]. Z neradioaktivních značek jsou nejčastěji používány fluorescein (FISH) a digoxigenin, jejichž následná vizualizace vede k lokalizaci dané sekvence DNA nebo RNA ve vzorcích tkání nebo buněk. Techniky ISH mohou být použity k identifikaci infekčních agens ve tkáňových sekvencích[2-4], lokalizaci genové exprese[5-6] nebo detekci specifické sekvence DNA buněk[7-9].
Při ISH na histologických a cytologických preparátech, jsou fixované tkáňové řezy nejdříve ošetřeny tak, aby byly odhaleny cílové sekvence DNA nebo mRNA. Vhodně označená sonda (např. fluoresceinem) je hybridizována s exponovanou cílovou sekvencí DNA nebo mRNA v buňkách. Následující promývací kroky odstraňují přebytečnou nehybridizovanou sondu, která není specificky vázána v tkáňovém řezu nebo buňkách.
Existují dvě základní možnosti vizualizace cílové sekvence DNA nebo RNA in situ. Základní princip metody je stejný, liší se přístrojovým vybavením. Fluorescenční in situ hybridizace (FISH), vyžaduje použití fluorescenčního mikroskopu. U chromogenní in situ hybridizace (CISH), probíhá hodnocení v procházejícím světle.
CISH – Chromogenní in situ hybridizace
Princip CISH odpovídá technice IHC, při kterém je na hybridizovanou sondu navázána myší protilátka (v tomto případě protilátka proti fluoresceinu nebo digoxigeninu) a následně sekundární protilátka s polymerem se standardní enzymovou značkou (HRP nebo AP). Po přidání substrátu vhodného pro enzym se na místě, kde je hybridizovaná sonda, vysráží barevný produkt[10-15]. Interpretace se provádí pod mikroskopem.
ISH má široké uplatnění, jako diagnostický nástroj v mnoha biologických a klinických oborech, jako je mapování chromozomů, karyotypizace a profilování patogenů. Riboprobes také umožňují lokalizaci a analýzu profilu genové exprese.
Reference
1. Polak, J.M., et al. In Situ Hybridization: Principles and Practice. Oxford University Press, Oxford, 1990.
2. P.J. Coates, et al. Detection of single copy of Epstein-Barr virus in paraffin wax sections by non-radioactive In Situ Hybridization. J. Clin. Pathol. 44:487-491, 1991.
3. Margiotta M., et al. Comparison of three commercial kits for in situ detection of viral DNA. J. Histotech. 19(2):139-142, 1996.
4. J.Embretson, et al. Analysis of human immunodeficiency virus infected tissues by amplification and In Situ Hybridization reveals latent and permissive infections at single cell resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:357-361, 1993.
5. Smith, K., et al. C-erbB-2 amplification in breast cancer: detection in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue by In Situ Hybridization. Hum. Pathol. 25:413-418, 1994.
6. M. Denijn, et al. Detection of calcitonin and calcitonin gene-related peptide mRNA in human medullary thyroid carcinoma: a retrospective study. J. Pathol. 169:53-56, 1993.
7. Poddighe, P.J., et al. Interphase cytogenetics of hematological cancer: comparison of classical karyotyping and In Situ Hybridization using a panel of eleven chromosome specific DNA probes. Cancer Res. 51:1959-1967, 1991.
8. Hopman, A.H., et al. Detection of numerical chromosome aberrations using In Situ Hybridization in paraffin sections of routinely processed bladder cancers. Mod. Pathol. 4:503-513, 1991.
9. Sauter, G., et al. c-myc copy number gains in bladder cancer detected by fluorescence In Situ Hybridization. Am. J. Pathol. 146:1131-1139, 1995.
10. Zhang ZS, et al. Detection of human papillomavirus DNA sequences in cervical lesion by In Situ Hybridization using biotinylated DNA probes. Chin Med J 1992 Apr 105:4 293-7.
11. Lassus J, et al. Comparison of four In Situ Hybridization methods, based on digoxigenin- and biotin-labeled probes, in detecting HPV DNA in male condylomata acuminata. Int J STA AIDS 1992 May-Jun 3:3 196-203.
12. Holm R, et al. In Situ Hybridization with nonisotopic probes using different detection system. Mod Pathol 1992 May 5:3 315-9.
13. Cao Y, et al. Development of a bispecific monoclonal antibody as a universal immunoprobe for detecting biotinylated macromolecules. J Immunol Methods 1998 Nov 1 220:1-2 85-91.
14. Kessler C. The digoxigenin: anti-digoxigenin (DIG) technology-a survey on the concept and realization of a novel bioanalytical indicator system. Mol Cell Probes 1991 Jun 5:3 161-205.
15. Mudgett-Hunter MM, et al. Binding and structual diversity among high affinity monoclonal anti-digoxigenin antibodies. Mol Immunol 1985 Apr 22:4 477-88.
DOPORUČUJEME
SONDY CISH
CerviPro HPV 14 fluoresceinem značená DNA Sonda kat.č. PR251-100
Koktejl sond HPV 14 byl navržena tak, aby rozpoznal oblasti L1 a E6/E7 otevřených čtecích vzorců (ORF) 14 genotypů lidského papilomaviru (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 a 68) v lidských tkáních zalitých parafínem nebo cytopatologických vzorcích či cervikálních stěrech.
CerviPro HPV Typ 16/18 fluoresceinem značená DNA sonda kat.č. PR250-100
Tato sonda byla navržena tak, aby rozpoznávala oblasti E1, E6, L1 a L2 otevřených čtecích vzorců (ORF) dvou nejčastějších high risk kmenů lidského papilomaviru (HPV) typu 16 a 18 v lidských tkáních zalitých parafínem nebo cytopatologických vzorcích či cervikálních stěrech.
Obě fluoresceinem značené sondy jsou dodávány v hybridizačním pufru pro in situ hybridizaci.
Reference:
1. De Gaintani C. et al. Detection of human papillomavirus DNA in urinary bladder carcinoma by in situ hybridization. J. Clin Pathol. 52(2), 103-6 (1999).
2. Caruso ML, Valentini AM. Different human papillomavirus genotypes in anogenital lesions. Anticancer Res., 19(4B), 3049-53(1999).
3. Mittal K. et al. A comparison of proliferative activity and atypical mitoses in cervical condylomas with various HPV types. Int. J. Gynecol. Pathol., 17(1), 24-8(1998).
4. Lie ES, et al. Detection of human papillomavirus in routinely processed biopsy sepecimens from larynegeal papillomas: Evalutation of reproducibility of polymeras chain reaction and DNA in situ hybridization procedures. Acta Otolaryngol. (Stockh), 116(4), 627-32(1996).
Detekční systém pro CISH
Vysoce sensitivní jednokrokový polymer-HRP ISH detekční systém
kat.č. DF400-50KE
Použití: IVD
Super SensitiveTM (ruční) & XISH (Xmatrx) One-Step Polymer HRP Detection System
Vlastnosti a výhody:
- čisté barvení bez pozadí endogenního biotinu
- vysoký poměr signálu k šumu pro intenzivní barvení
- vysoká citlivost v důsledku použití polymeru(HRP) jako detekčního činidla
- univerzální systém pro všechny sondy označené fluoresceinem
- přesná orientace vzorku s definovanou nulovou pozicí
- k dispozici je kit v balení pro manuální metodu (Super Sensitive kit) nebo pro automatickou metodu v automatickém hybridizéru XmatriX, značený RFID (XISH kit).
- velmi vysoká specifita, která je inherentní k sondě značené haptenem a k interakci nukleové kyseliny
FISH – Fluorescenční in situ hybridizace
Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) se stala známou metodou pro genetické mapování a profilování genové exprese. Tato technika používá sondy značené fluorescenčním barvivem, které se váží na nukleotidovou sekvenci DNA, která je mapována nebo lokalizována na chromozomu nebo intranukleární DNA za vzniku fluorescenčního signálu, který je vizualizován mikroskopií in-situ. Hybridizace sondy na odpovídající nukleotidovou sekvenci umožňuje detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti specifických sekvencí, mapování bodů zlomu translokace a stanovení počtu genových kopií.
Jako diagnostického nástroje je FISH hojně používána v klinické genetice a patologii, neurovědách, reprodukční medicíně, toxikologii, mikrobiální ekologii, evoluční biologii, srovnávací genomice, buněčné genomice a biologii chromozomů, aby se ověřily genetické abnormality v prenatální diagnostice, spojené s vrozenými vadami a mentální retardací. Pomocí FISH je možné ve stejné tkáni rozlišovat benigní a maligní nádory. Používá se také k predikci chování nádrových onemocnění při specifické léčbě. Tradiční morfologické metody jsou pro tyto účely nedostačující, protože úroveň exprese proteinů nemusí odpovídat genetické dispozici či je tato dispozice při běžném vyšetření neidentifikovatelná (např. zlomy…) a proto je třeba některé nádory rozlišit již na molekulání úrovni. FISH umožňuje vyšetřit tkáně na přítomnost genetických abnormalit jako běžných biomarkerů.
DOPORUČUJEME
Detekční systémy FISH
Tyto kity jsou určeny pro použití při fluorescenční in situ hybridizaci (FISH) a jsou optimalizovány pro specifickou fluorescenční detekci fluorescenčně značených sond nukleových kyselin po hybridizaci na cílovou DNA nebo RNA/mRNA sekvenci.
Histologický kit – eFISH Histo kat. č. DF500-20XE
Vhodné pro řezy tkáně fixované formalinem a zalité parafínem (FFPE) .
Cytologický kit – eFISH Cyto kat. č. DF510-20XE
Vhodné pro řezy připravené z cytologických a hematologických vzorků, skvrn i buněk. K přípravě vzorku kostní dřeně může být zapotřebí dekalcifikace.
