Kvantitativní a reprodukovatelná biokonjugace s technologií SoluLINK®

Úvod

Biokonjugace je chemické propojení dvou biomolekul do formy jedné hybridní, která si zachovává biologickou aktivitu každé své součásti a navíc přináší nové funkce, které při použití samostatných biomolekul nejsou možné. Většina komplexních molekul, například proteiny, se nachází ve funkčním stavu pouze ve vodném prostředí. Z toho důvodu musí být příprava biokonjugátů provedena ve vodných roztocích a každá použitá chemická složka pro biokonjugaci musí zachovávat biologickou aktivitu a funkci biomolekul v tomto typu prostředí. Konjugáty jsou obecně tvořeny připojením samostatných, ale komplementárních funkčních skupin na každou ze dvou biomolekul. Tyto funkční skupiny jsou typicky zavedeny procesem modifikace, který sestává z připojení linkeru k amino nebo thio skupině přítomné v zájmové molekule. Dvě modifikované biomolekuly jsou poté smíchány dohromady za účelem vytvoření požadovaného biokonjugátu přes komplementární linkery inkorporované v průběhu modifikace. Obr. 1 představuje typický průběh tohoto modifikačního a konjugačního procesu.

Konjugace a imobilizace biomolekul byla dříve problematická především z toho důvodu, že ve vodě probíhá málo reakcí vedoucích k vytvoření kovalentní vazby, které by též mohly řízeně vést k propojení biomolekul za mírných a kontrolovaných podmínek. Několik metod konjugace a imobilizace biomolekul je popsáno v různých publikacích, většina těchto metod je však obtížně reprodukovatelná, stechiometricky neefektivní a s nízkou výtěžností konjugátu.

Při výběru konjugačního postupu je třeba mít na mysli žádoucí vlastnosti biokonjugačních technologií. Následující výčet obsahuje kritéria požadovaná pro vývoj:

• Linkery musí být do biomolekuly inkorporovány mírnou a kontrolovatelnou reakcí ve vodném roztoku způsobem, který zachová nedotčené zásadní funkce a vlastnosti biomolekuly.

• Konjugační vazby by se měly tvořit pouze mezi dvěma komplementárními linkery vnesenými do molekuly v průběhu modifikace a nikoliv mezi funkčními skupinami náležícími samotné biomolekule.

• Inkorporace linkeru a tvorba konjugátu by měla být snadno kvantifikovatelná jednoduchou nedestruktivní metodou, např. spektrofotometricky.

• Modifikované biomolekuly s připojeným linkerem a již propojený konjugát by měly být stabilní v širokém rozmezí pH a za vyšších teplot.

• Kinetika konjugační reakce by měla být rychlá a stechiometricky efektivní.

• Linkery by měly být snadno inkorporovatelné do rozmanitých biomolekul včetně oligonukleotidů a peptidů v průběhu syntézy na pevné fázi (solid phase synthesis).

• Konjugační reakce by měla probíhat přímo po smíchání dvou modifikovaných molekul, bez přídavku dalších reagencií, které by mohly narušit jejich funkce, např. oxidační a redukční činidla či kovy.

• V průběhu modifikace nebo konjugace by neměla probíhat žádná další kovalentní reakce.

Obr. 1 – Schéma biokonjugačního procesu SoluLINK 

Biokonjugační technologie SoluLINK je jediná technologie splňující tato přísná kritéria. Šetrně, efektivně a reprodukovatelně konjuguje a imobilizuje všechny druhy biomolekul včetně proteinů, peptidů, oligonukleotidů, polysacharidů, léčiv a povrchů. Chemická reakce je založena na reakci aromatického hydrazinu s aromatickým aldehydem, které tvoří stabilní bis-arylhydrazonovou konjugovanou vazbu (Obr. 1). K inkorporaci 6-hydrazinonikotinamidové skupiny (HyNic) do aminů je použit S-HyNic. Tento linker obsahuje sukcinimidilový ester (NHS ester), který ochotně reaguje s proteinovými aminoskupinami, aminy obsaženými v jiných biomolekulách a povrchy umožňující standardní podmínky reakce NHS esteru (např. fosfátový pufr, pH 7,5-8,0). Aromatický aldehyd je vnesen do biomolekuly stejným způsobem pomocí S-4FB (Obr. 1). 

Pro modifikaci molekul pomocí thiolových skupin je k dispozici thiol-reaktivní maleimidová verze HyNic (MHPH; 3-N-maleimido-6-hydraziniumpyridine hydrochloride) k inkorporaci do HyNic linkerů. Tato sloučenina je vhodná především pro místně specifické konjugace protilátek přes jejich místo „ohybu“ (hinge region, mezi Fab a Fc fragmenty) po šetrné redukci pomocí DTT nebo TCEP, přičemž výsledkem je konjugát protilátka-léčivo. Též lze využít pro konjugaci biomolekul obsahujících volné cysteiny nebo redukovatelné disulfidické vazby.

Jednoduché smíchání biomolekuly modifikované HyNic s biomolekulou modifikovanou 4FB v mírně kyselém pufru (např. fosfátový pufr, pH 6,0) vede k vytvoření požadovaného konjugátu. Hydrazinová funkční skupina S-HyNic je chráněna ve formě aceton hydrazonu a ve vodném roztoku je v rovnováze s volným reaktivním hydrazinem. Tím je HyNic skupina volná k reakci s aromatickým aldehydem bez nutnosti dalšího kroku k její aktivaci a spontánně tvoří stabilní bis-arylhydrazon. Na rozdíl od alifatických hydrazonů je bis-arylhydrazonová vazba teplotně a pH stabilní (při 95 °C dvě hodiny, pH 2-10), jak je vidět na Obr. 2. 

Linkery SoluLINK jsou dostupné v dalších variantách, které dále rozšiřují univerzálnost této technologie. To zahrnuje štěpitelné disulfidické linkery (S-SS-4FB) a ve vodě rozpustné sulfo-NHS esterové verze HyNic a 4FB. HyNic části jsou navíc snadno inkorporovatelné do peptidů v průběhu jejich syntézy na pevné fázi pomocí Boc-HNA. Obdobně 4FB jdou snadno připojit pomocí A4FB fosforamiditů během syntézy oligonukleotidů na pevné fázi.

Obr. 2 – PAGE analýza peptido-oligonukleotidových konjugátů připravených SoluLINK technologií. Konjugace dvou N-koncových HyNic-modifikovaných peptidů s 5´-4FB-modifikovaných oligonukleotidů (22-merů) za vzniku peptido-oligonukleotidového konjugátu (sloupce 4 a 5). Tvorba konjugátu byla kvantifikována reakcí ve stechiometrickém poměru oligonukleotid:peptid 1:2. Stabilita konjugační vazby byla testována zahřátím na 95 °C v PBS po dobu 2 hodin (sloupce 6 a 7). Vizualizováno pomocí UV.

Další neobyčejně výhodná vlastnost SoluLINK bis-arylhydrazonové vazby je schopnost tvořit sledovatelné chromofory. Absorpční maximum těchto chromoforů je při 354 nm s molárním extinkčním koeficientem 29 000 L.mol-1.cm-1. Tato unikátní vlastnost je exkluzivní pro SoluLINK biokonjugační technologii a je vhodná pro:

• Snadnou kvantifikaci množství linkerů připojených ke každé molekule před konjugací.

• Sledování průběhu konjugační reakce v reálném čase.

• Přímou kvantifikaci množství vazeb vzniklých v konjugátu a přesný počet připojených biomolekul nebo ligandů.

• Vizualizaci píku konjugátu při FPLC nebo HPLC purifikaci a identifikaci frakcí obsahujících požadovaný konjugát.

• Jednoduchou a nedestruktivní kvantifikaci.

Tyto vlastnosti umožňují dosud nevídanou úroveň regulace množství vnášených linkerů do každé biomolekuly, stejně jako stupně konjugace mezi biomolekulami. Jakmile je dosaženo určité hodnoty absorbance hydrazonu v průběhu konjugačního procesu, je možné reakci zastavit pomocí přídavku přebytku sulfobenzaldehydu k překrytí zbývajících HyNic skupin. Tímto způsobem lze získat předem definované množství vzniklého konjugátu s vysokou mírou reprodukovatelnosti mezi jednotlivými šaržemi. Tato úroveň regulace je zvláště vhodná pro výrobu dle GMP.

Rychlá konjugace je žádoucí pro zvýšení efektivity konjugačního procesu a snížení nákladů na reagencie. Dirksen et al.1, 2 ukázali, že anilin prokazatelně urychluje tvorbu bis-arylhydrazonové vazby (Obr. 3, se svolením autorů). Toto výrazné zvýšení reakční rychlosti usnadňuje konjugaci velkých biomolekul a jejich imobilizaci na povrchy, což dříve probíhalo velmi pomalu a neefektivně. Jak je vidět na Obr. 3, konjugace HyNic-peptidu s 4FB probíhá během tří minut s přídavkem 100 mM anilinu (SoluLINK TurboLINK® Buffer). Vysoká efektivita konjugační reakce je výsledkem snížení času nutného pro konjugaci, snazší purifikace výsledného konjugátu, průkazného snížení materiálních nákladů a lepší reprodukovatelnosti. 

Obr. 3 – Konjugace HyNic peptidu s benzaldehydem bez nebo při katalýze anilinem (a). Tvorba produktu detegovaná v reálném čase pomocí UV-VIS spektrofotometrického měření výsledné chromogenní konjugované vazby při 340 nm (b).

Další metody přípravy kovalentních konjugátů pomocí azid-alkyn „click chemie“ nebo párování maleimid-thiol

Nevýhody „click chemie“

• Potřeba katalýzy těžkými kovy, která může způsobit degradaci biomolekuly. Např. měď může způsobovat zlomy v řetězcích DNA a RNA, stejně jako oxidaci aminokyselin v proteinech tvorbou reaktivních forem kyslíku.

• Nekatalyzovaná reakce založená na zřetězených cykloalkynech probíhají kineticky pomaleji než reakce katalyzované mědí a jsou též méně výtěžné.

• Některé cyklooktynové linkery mohou reagovat s cysteiny v proteinech, snižovat bio-ortogonalitu reakce a případně i narušit funkci biomolekuly. 

• Zřetězené cykloalkyny jsou typicky silně hydrofobní a mohou způsobit agregaci nebo precipitaci biomolekul, stejně jako ztrátu funkce po propojení linkerů.

Nevýhody maleimid-thiol

• Nestabilita ve vodném prostředí (hydrolýza) maleimidových funkčních skupin na biomolekule limituje její vhodnost jakožto propojovacího činidla.

• Potřeba ochrany a zrušení ochrany thiolových skupin zprostředkovaná heterobifunkčními linkery.

• Potřeba aktivace některých chráněných thiolových skupin přídavkem redukčního činidla může poškodit funkce biomolekuly.

• Potenciální nežádoucí tvorba homodimerů v důsledku tvorby disulfidických můstků nebo změnou uspořádání disulfidů.

SoluLINK biokonjugační technologie splňuje náročné požadavky na produkci diagnostických a terapeutických biokonjugátů. Technologie SoluLINK je široce aplikovatelná a umožňuje konjugaci všech skupin biomolekul. Navíc, peptidy a oligosacharidy, jakožto významné skupiny biomolekul, mohou být syntetizovány pomocí HyNic a 4FB v průběhu syntézy na pevné fázi. Schopnost jednoduše kvantifikovat počet linkerů na biomolekule a počet výsledných konjugačních vazeb umožňuje regulovat a kontrolovat biokonjugační proces, čehož alternativní technologie nedosahují.

Produkty a příklady biokonjugátů

Detekce biotinu a značení digoxigeninem prostřednictvím ChromaLINK®

Přesná a řízená inkorporace značek jako jsou biotin nebo digoxigenin do biomolekul je stále problematická z důvodu základního nedostatku vnitřních chromoforů nebo jiných sledovatelných indikátorů v těchto značkách. Tento problém je řešen tím, že ChromaLINK Biotin a Digoxigenin jsou navrženy s inkorporovaným SoluLINK UV detegovatelným bis-arylhydrazonovým chromoforem v raménku linkeru každé této molekuly. Spektrofotometrická kvantifikace úrovně vnesení těchto značek je přímá a vysoce reprodukovatelná. Jednoduché měření absorbance modifikovaného proteinu při 280 nm a 354 nm umožňuje zjistit jak koncentraci proteinu, tak množství inkorporovaného haptenu (Obr. 4). 

Obr. 4 – Struktura ChromaLINK Biotinu a Digoxigeninu (nahoře). UV-VIS spektra nemodifikované protilátky a protilátky modifikované ChromaLINK Biotinem (dole). Množství molekul ChromaLINK Biotinu a Digoxigeninu na protein je jednoduše vypočitatelné z hodnot absorbance při 280 nm a 354 nm.

Pro značení protilátek slouží soupravy ChromaLINK Biotin a Digoxigenin One-Shot™ Kit obsahující vše potřebné k označení 100 µg protilátky, purifikaci konjugátu a kvantifikaci inkorporace těchto značek. ChromaLINK Biotin Protein Labeling Kit jsou k dispozici pro řízenou a sledovatelnou biotinylaci libovolného proteinu o velikosti 20-200 kDa v množství od 25 µg do 1 mg.

Multiplexování v imunodetekčních technikách, jakými je imunofluorescence, bylo tradičně poměrně omezeno relativně nízkým počtem dostupných protilátek různého zvířecího původu. Takto je limitována aplikace značených sekundárních protilátek proti jednotlivým zvířecím protilátkám při použití jedné tkáně nebo buněčného vzorku. Pro mnohé laboratoře proto může být zajímavé, že při použití ChromaLINK Biotinu a Digoxigeninu mohou být primární protilátky od stejného druhu značeny hapteny a následně detegovány fluorescenčními konjugáty se streptavidinem či anti-Dig protilátkami. Vše probíhá ve stejném vzorku bez křížové reaktivity. Navíc díky tomu, že primární protilátky obsahují mnoho haptenů k vazbě značených detekčních molekul, je signál v porovnání s přímo značenými primárními protilátkami výrazně vyšší. Obr. 5 ukazuje použití ChromaLINK Biotinem a Digoxigeninem modifikovaných protilátek při multiplexním imunofluorescenčním barvení s použitím primárních protilátek ze stejného zvířecího druhu (myši).

Obr. 5 – ChromaLink Biotinem a Digoxigeninem značené primární myší protilátky v multiplexním imunofluorescenčním barvení. Mozková tkáň z krys Sprague Dawley byla inkubována s nekonjugovaným myším anti-krysím/lidským kalbindinem D, následovala detekce oslí anti-myší sekundární protilátkou konjugovanou s NorthernLights™ NL-637 (far-red fluorescence). Tkáň byla následně po promytí PBS inkubována s ChromaLINK Biotinem značeným myším anti-krysím Synaptotagminem-1 a ChromaLINK Digoxigeninem značeným myším anti-krysím/lidským CART. Detekce těchto myších primárních protilátek byla provedena použitím směsi konjugátu Streptavidin-NorthernLights NL-493 (zelená fluorescence) a myšího anti-digoxigeninu konjugovaného s Rhodamine Red™-X (červená fluorescence). K barvení jader bylo užito DAPI (modrá fluorescence).

Konjugace protilátka-oligonukleotid

Obtížnost efektivní a reprodukovatelné přípravy konjugátů protilátek s oligonukleotidy omezuje jejich využití v multiplexních diagnostických metodách. SoluLINK Antibody-Oligonucleotide All-in-One™ Conjugation Kit tyto problémy řeší. Konjugační souprava je stechiometricky efektivní i vysoce výtěžná, začleňuje >95 % protilátky do oligonukleotidového konjugátu (viz Obr. 6). Navíc oligomery o délce 20-60 nukleotidů jsou konjugovány se stejně vysokou efektivitou. Metoda je extrémně šetrná, jelikož ke konjugaci nejsou použity žádné kovy, redukční ani oxidační činidla. Dalšího zvýšení efektivity konjugace je možné dosáhnout použitím anilinu jakožto katalyzátoru reakce, který signifikantně snižuje reakční dobu. Souprava je navržena k inkorporaci 2-3 oligonukleotidů na protilátku, pokud je použit ekvivalent 4-5 oligonukleotidů.

Jako další průlom v přípravě konjugátů protilátka-oligonukleotid zahrnuje metoda purifikaci konjugátu pomocí adsorpce na vyvinutou magnetickou afinitní matrici, která umožňuje odstranění přebytečných oligonukleotidů. Následuje jemná eluce vysoce přečištěného konjugátu. Celkový výtěžek konjugátu protilátka-oligonukleotid se pohybuje mezi 30-50 % v závislosti na znovuzískání protilátky v purifikačním kroku. Čistota konjugátu je více než 95 % a obsahuje pouze minimum samostatných protilátek a oligonukleotidů, což činí konjugáty připravené touto soupravou vhodné pro zvlášť náročné aplikace. Více konjugátů může být snadno připraveno simultánně, což splňuje požadavek na více konjugátů protilátka-oligonukleotid pro vícenásobná detekční schémata.

Obr. 6 – Konjugace protilátka-oligonukleotid. Obrázek zobrazuje stříbrem barvenou DNA v SDS-PAGE gelu v neredukujícím prostředí a demonstruje efektivní konjugaci 40-merního (sloupce 2-4) a 20-merního (sloupce 6 a 7) oligonukleotidu s protilátkou. Po konjugační reakci obou oligonukleotidových vzorků nezbývají prakticky žádné nekonjugované protilátky (sloupce 3 a 6). Purifikované konjugáty (sloupce 4 a 7) neobsahují žádné zbývající nekonjugované oligonukleotidy. 

Konjugace protein-protein

SoluLINK All-in-One Conjugations Kit využívá k produkci vysoce kvalitních konjugátů protilátek s vysokou výtěžností efektivity hydrazonových párů. Tato souprava umožňuje přípravu konjugátů protein-protein, jako jsou HRP-protilátka a PE-protilátka pro zvlášť náročné aplikace. Každá souprava obsahuje praktickou centrifugační purifikační kolonku k odstranění přebytečných značek pro dosažení nejlepšího poměru signálu k šumu a vysoké citlivosti bez nutnosti chromatografické separace. Na Obr. 7 jsou v gelu vizualizovány výsledky konjugace HyNic-protilátky s 4FB-HRP pomocí HRP-Antibody All-in-One Conjugation Kit. Každá souprava kompletně modifikuje protilátku na konjugát, beze zbytků nekonjugované značky. SoluLINK Protein-Protein Conjugation Kit umožňuje jednoduchou a rychlou konjugaci proteinů o molekulární hmotnosti v rozsahu 25-950 kDa.

Obr. 7 – Konjugace protein-protein. Gel barvený coomassie blue s konjugátem protilátka-HRP. Popis gelu: proteinový standard molekulových hmotností (sloupec 1), HyNic-modifikovaná protilátka (sloupec 2), nepurifikovaná konjugační reakce (sloupec 4), purifikovaný konjugát protilátka-HRP (sloupec 5). Polymerní konjugáty protilátka-HRP poskytované HRP-Antibody All-in-One Conjugation Kit poskytují oproti konjugátům s nižším poměrem HRP ku protilátce zvýšenou citlivost pro aplikace jako je ELISA a imunohistochemie.

Konjugace peptid-oligonukleotid

Příprava konjugátů peptid-oligonukleotid s využitím tradičního maleimid-thiolového postupu je obtížná co do provedení a opakovatelnosti a vyznačuje se nízkou výtěžností. SoluLINK technologie výrazně zjednodušuje proces konjugace, jelikož komplementární linkery mohou být vneseny do příslušných sekvencí během syntézy na pevné fázi. Například HyNic může být inkorporován do sekvence či na N- nebo C-konec během syntézy peptidů na pevné fázi pomocí Boc-HNA (Obr. 8). 4FB skupina může být pomocí A4FB-fosforamiditu připojena na 5´-konec oligonukleotidu během syntézy (Obr. 8). Alternativně může být 4FB skupina připojena na 5´- nebo 3´-konec oligonukleotidu jednoduchou a vysoce výtěžnou konverzí amino oligo použitím S-4FB. Jednoduché smíchání a inkubace 4FB-oligonukleotidu s 2 až 3násobným přebytkem HyNic-peptidu a následnou purifikací pomocí diafiltrace vede k zisku konjugátu v téměř kvantitativním výtěžku. 

Obr. 8 – Struktura Boc-HNA a 4FB-fosforamiditu. Boc-HNA je používáno k připojení HyNic k N- a C-konci peptidu během jeho syntézy na pevné fázi. 4FB-fosforamidit připojuje 4FB k 5´-konci oligonukleotidu během jeho syntézy na pevné fázi.

Streptavidinové magnetické kuličky a agarosa

NanoLINK® Streptavidin Magnetic Beads (magnetické kuličky, 1 µm) a MagnaLINK® Streptavidin Magnetic Beads (2,8 µm) poskytují až 15 krát vyšší vazebnou kapacitu pro biotin ve srovnání s jinými komerčně dostupnými produkty (Obr. 9). Toho je dosaženo imobilizací streptavidinu značeného HyNic na povrch kuliček, který je aktivovaný 4FB pomocí SoluLINK biokonjugační technologie, jak je vidět na Obr. 10. Výjimečná efektivita párování SoluLINK technologie vede k mnohem většímu množství připojeného streptavidinu v porovnání s konkurenčními produkty. Vyšší vazebná kapacita umožňuje použití menšího množství pevné fáze (kuliček) k zachycení daného množství cílového biotinylovaného proteinu nebo jiné biomolekuly, což vede k úměrně nižšímu pozadí a nižším nákladům.

Obr. 9 – Srovnání vazebné kapacity pro biotin u NanoLINK a MagnaLINK streptavidinových magnetických kuliček a konkurenčních metod

Obr. 10 – Ilustrační schéma řezu streptavidinovou magnetickou kuličkou NanoLINK a MagnaLINK

SoluLINK Streptavidin Agarose Ultra Performance™ byla vyvinuta s důrazem na důležité klíčové parametry – vysoká vazebná kapacita pro biotin a málo nespecifických vazeb, vše na vysoce prokříženém 6% agarosovém nosiči. Výsledkem je vysoký průtok s konzistentní prostupností, stejně jako nejvyšší vazebná kapacita biotinu na každé agarosové částici na trhu (Obr. 11). Streptavidin je imobilizován na částicích agarosy s resinem pomocí SoluLINK technologie a výsledkem je vysoká hustota a stabilita imobilizace s minimálním odmýváním proteinu. Navíc, oproti jiným konjugačním strategiím jako je bromkyan, zanechává konjugace SoluLINK agarosu bez náboje, který by mohl vést k dalším interakcím s biomolekulami, a tedy i nechtěným nespecifickým vazbám a pozadí. Jádro agarosy je speciálně připraveno tak, aby bylo unikátně uniformní s relativně malým průměrem 35 µm. Tyto vlastnosti spojené s vysokým stupněm prokřížení částic vedou k získání resinu, který je odolný k vysokému tlaku a centrifugačním silám často se vyskytujícím ve vysokorozlišovacích a purifikačních metodách.

Obr. 11 – Srovnání vazebné kapacity pro biotin u Streptavidin Agarose Ultra Performance a konkurence.

Souhrn

SoluLINK biokonjugační technologie byla vyvinuta k efektivní a jednoduché přípravě konjugátů biomolekul. Tato technologie je na vyšší úrovni než klasické metody a lépe vyhovuje náročným požadavkům diagnostických a terapeutických aplikací. Schopnost snadno kvantifikovat inkorporaci linkeru a tvorbu konjugátu umožňuje jedinečnou úroveň reprodukovatelnosti tvorby konjugátu. Technologie SoluLINK byla citována ve stovkách výzkumných prací a je celosvětově využívána množstvím špičkových biotechnologických společností k produkci biokonjugátů pro diagnostické a terapeutické účely.

Tabulka pro výběr produktů

Reference:

• Dirksen, A., & Dawson, P.E. (2008). Rapid Oxime and Hydrazone Ligations with Aromatic Aldehydes for Biomolecular Labeling. Bioconjugate Chem., 19(12), 2543–2548. doi:10.1021/bc800310p 

• Dirksen, A., Dirksen, S., Hackeng, T.M., & Dawson, P.E. (2006). Nucleophilic Catalysis of Hydrazone Formation and Transimination: Implications for Dynamic Covalent Chemistry. J. Am. Chem. Soc., 128(49), 15602-15603. doi:10.1021/ ja067189k

(Převzato od společnosti Vector Laboratories, redakčně upraveno.)