Imunochemické metody, které využívají protilátky k analytickému stanovení proteinů, mají velké využití v klinické diagnostice i ve vývoji léků. Mezi tradiční metody patří zejména Western blot, o které jsme již psali, ELISA a RIA.
Porovnání všech tří metod jsme před nedávnou dobou publikovali na blogu.
V tomto příspěvku s vámi chceme sdílet “troubleshooting” pro metodu ELISA. Věříme, že poznatky obsažené v tomto článku vám budou ku pomoci v případech, kdy experimenty nevycházejí tak, jak by měly.
Prvním krokem při hledání problémů je připravit si čerstvé pufry. Pufry obsahující BSA před použitím sterilizujte přefiltrováním a ostatní reagencie před použitím vytemperujte na laboratorní teplotu.
| Problém | Možný zdroj | Návrh řešení |
| Vysoké pozadí / Vývoj nespecifického zbarvení | Nespecifická vazba protilátky | Upravte použitý blokovací pufr (např. zaměňte kasein za BSA). Po blokování neprovádějte promývání; desku vyklepněte, osušte a pokračujte k dalšímu kroku. |
| Deska není dostatečně promytá | Během každého promývacího kroku se ujistěte, že jsou všechny jamky naplněny pufrem. Také se ujistěte, že promývací zařízení pracuje správně. Mezi jednotlivými kroky promývejte 3 – 5x. Nepřidávejte další promývací krok. Po posledním promytí osušte destičku silným klepnutím na papírovou utěrku, aby se odstranil zbytkový pufr. Ujistěte se, že do promývacího roztoku bylo přidáno správné množství Tweenu (doporučeno 0,01 – 0,1%). | |
| Kontaminované pufry | Připravte si všechny pufry čerstvé (maximálně 7 dní před použitím) a sterilizujte je filtrací. | |
| Inkubační teplota je příliš vysoká | Inkubuje se při pokojové teplotě (25ºC) v průběhu celého postupu. | |
| Inkubační doba je příliš dlouhá | Zkraťte inkubační čas. | |
| Kontaminace substrátu konjugátem nebo kontaminace slepých vzorků pozitivní kontrolou | Mezi pipetováním jednotlivých činidel měňte špičky i nádoby na reagencie. V ideálním případě by měl být promývací pufr odsáván, aby v důsledku vyklepnutí nedocházelo ke cross-kontaminaci. | |
| Koncentrace detekční protilátky nebo avidin-HRP je příliš vysoká | Zkontrolujte výpočty nebo zkuste další ředění. | |
| Substrát byl před použitím vystavený světlu | Substrát uchovávejte ve tmě do poslední chvíle před experimentem a jeho aplikací do jamek. | |
| Při odečtu byl použit nesprávný filtr | Při použití doporučených desek by měla být vlnová délka 405nm s korekcí vlnové délky 650nm pro ABTS, nebo 450nm s korekcí vlnové délky 620nm pro TMB. | |
| Měření desky ve špatnou dobu vzhledem k vyvíjení | Monitorujte O.D. slepého vzorku a provádějte měření v 5 minutových intervalech. | |
| Slabý / žádný vývoj zbarvení | Vynechání kroku nebo opomenutí aplikace činidla | Zkontrolujte protokol a pečlivě postupujte podle návodu, krok za krokem. |
| Koncentrace detergentu v promývacím pufru je příliš vysoká | Odstraňte nebo snižte koncentraci detergentu (doporučuje se 0,01 – 0,1%). | |
| Příliš promytá deska | Snižte počet promytí mezi kroky, zejména pokud nepoužíváte automatickou nebo poloautomatickou promývací stanici. 1-2 promytí by měla stačit. | |
| Přítomnost enzymového inhibitoru ve vzorku | Azid sodný inhibuje aktivitu peroxidázy. | |
| Špatná délka inkubace nebo teplota | Zkontrolujte a dodržujte doporučení protokolu. Během inkubačních kroků umístěte destičku do inkubátoru, aby se předešlo výkyvům teploty (25 °C). | |
| Do jamek byl přidán nesprávný objem substrátu | Zkontrolujte pipetu; použijte kalibrované pipety. | |
| Byl použit nesprávný systém enzym-substrát | Zkontrolujte specifikace výrobce:
avidin-HRP + ABTS / streptavidin + TMB. |
|
| Neaktivní konjugát nebo substrát | Otestujte aktivitu v jiném systému a zkontrolujte datum expirace reagencií. | |
| Nesprávné skladování jednotlivých složek | Uložte všechny složky podle doporučení v produktovém listu. | |
| Při odečtu byl použit nesprávný filtr | Při použití doporučených desek by měla být vlnová délka 405nm s korekcí vlnové délky 650nm pro ABTS, nebo 450nm s korekcí vlnové délky 620nm pro TMB. | |
| Špatná standardní křivka | Nesprávná příprava standardu | Roztoky standardů připravte znovu dle návodu. Ředění provádějte jen doporučenými ředícími pufry. V případě použití jiných ředících pufrů je potřeba udělat optimalizaci. |
| Ředění byla provedena příliš brzy | Reagencie připravte těsně před použitím a okamžitě přidejte do jamek. | |
| Vazebná protilátka se nenavázala | Použijte destičky vhodné pro ELISA (tj. Corning 9018, 3361, 3366); ne kultivační desky pro buněčné kultury. | |
| Neefektivní promytí | Ujistěte se, že promývací zařízení pracuje správně (tj. aplikuje shodné objemy do každé jamky). Ujistěte se, že jsou jamky po odsátí prázdné, ale nezapomeňte je opět včas naplnit. | |
| Chyba pipetování | Kapaliny vypouštějte z pipety rychle a identickým způsobem po stěně každé jamky. Používejte kalibrované pipety. | |
| Měření desky ve špatnou dobu vzhledem k vyvíjení | Obecně lze říci, že spolehlivé standardní křivky jsou u souprav ABTS dostávány, pokud O.D. nepřesahují u slepých vzorků hodnotu 0,2 a u nejvyšší standardní koncentrace 1,2. U TMB by slepé vzorky neměly přesahovat hodnotu 0,15. | |
| Nesprávné skladování jednotlivých složek | Uložte všechny složky podle doporučení v produktovém listu. Rehydratované/Rozpuštěné reagencie neponechávejte delší dobu při laboratorní teplotě. | |
| Špatná přesnost | Nedostatečné promíchání činidel | Před pipetováním zajistěte dostatečné promíchání reagencií. |
| Neefektivní promytí | Ujistěte se, že promývací zařízení pracuje správně (tj. aplikuje shodné objemy do každé jamky). Ujistěte se, že jsou jamky po odsátí prázdné, ale nezapomeňte je opět včas naplnit. | |
| Chyba pipetování | Kapaliny vypouštějte z pipety rychle a identickým způsobem po stěně každé jamky. Používejte kalibrované pipety. | |
| Recyklované materiály | Mezi inkubačními kroky vyměňujte pipetovací špičky, zásobníky na reagencie a víčka/fólie desek. | |
| Jamky byly poškrábány špičkami pipety nebo mycím zařízením | Při dávkování i aspiraci postupujte opatrně. | |
| Sraženiny ve vzorcích | Vialky před použitím zcentrifugujte. | |
| Znečištění jamek či povrchu desky | Před použitím si jamky prohlédněte a případné odstraňte nečistoty.
Před odečítáním spodní část desky otřete, abyste odstranili veškeré nečistoty nebo otisky prstů. |
|
| Změny na okrajích | Vypařování | Mezi jednotlivými kroky zakrývejte desku fólií nebo víčkem. |
| Nerovnoměrná teplota | Během inkubačních kroků umístěte destičku do inkubátoru, aby se předešlo výkyvům teploty (25 °C).
Desky neskládejte na sebe. |
Další zajímavé články o Imunochemických metodách:
Průvodce řešením problémů – Western blot
ELISA, Multiplex array, Western blot a RIA, která metoda je „ta pravá“?