Inovativní povrchy 21. století

Většina původních plastových laboratorních nádob byla vyrobena z polystyrenu, dlouhého polymerního uhlíkového řetězce s benzenovými jádry připojenými ke každému druhému uhlíku. Polystyren byl vybrán pro svou vynikající optickou čistotu. Je snadno tvarovatelný a poměrně nenákladný. Má však také jednu významnou nevýhodu: je velmi hydrofobní (nesmáčivý), tudíž se na něj buňky obtížně adherují. Naštěstí může být povrch polystyrenu snadno modifikován různými chemickými (kyselina sírová) nebo fyzikálními metodami (koronový výboj, plynová plazma nebo ozařování). Použitím těchto způsobů je možno na polymer polymorfně navázat hydroxylové, ketonové, aldehydové, karboxylové a aminové skupiny. Tyto skupiny mění povrchové charakteristiky, které mění nenabitý hydrofobní povrch na iontově hydrofilnější. Polystyren může být také modifikován chemickými reakcemi, aby se umožnilo kovalentní připojení různých reaktivních skupin, které mohou být použity pro následnou kovalentní imobilizaci biomolekul.Inovativní povrchy 21. století

povrchy usnadňující adhezi

• Corning CellBIND
• Tissue Culture Treated (TCT) – Standardní polystyren ošetřený pro tkáňové kultury
• Polystyren potažený poly-D-lysinem

povrchy zabraňující adhezi

• Ultra-Low Attachement – Polystyren s povrchem s nízkou přilnavostí
• Untreated polystyrene – Neošetřený polystyren

speciální povrchy

• Corning Osteo Assay
• Substrát Synthemax® II-SC

Povrchy usnadňující adhezi

CellBIND

Patentovaný povrch využívající mikrovlnného plazmatu, který zvyšuje buněčnou adhezi, umožňuje snížení obsahu séra a eliminuje nutnost koutování

Aplikace:

užitečné pro pěstování „obtížných“ buněk, jako jsou:

• primární kultury
• transfekované buňky, které nadměrně exprimují proteiny
• buňky, které běžně vyžadují koutování

Výhody:

• zvýšení adheze, zlepšení proliferace buněk a zlepšení výtěžků
• zlepšení adheze buněk za obtížných podmínek jako je médium somezeným množstvím séra nebo sérum-free médium, což vede k vyšším výtěžkům buněk (až o 60 % vyšší výtěžky při sklizni)

Toto optimalizované povrchové ošetření zvyšuje obsah kyslíku na povrchu polymeru, což vede ke zvýšení hydrofilnosti a smáčivosti a díky tomu je zlepšeno rozptýlení a adheze buněk. Důležité je, že povrch CellBIND® obsahuje o 68 % vyšší hladiny kyslíku než standardní povrch ošetřený pro tkáňové kultury (TCT) a o 105 % více než konkurenční aminové povrchy.

Kultivační nádoby se vyrábí z vysoce kvalitního polystyrenu, který je tvarován a následně zpracován pomocí energie a plynu, aby byla vytvořena drsnost a hydrofilnost povrchu, která je nezbytná pro absorpci proteinů a připojení buněk. Toto ošetření může být rozděleno na dva komerční typy ošetření. Atmosférickou plazmovou úpravu, při níž je zdroj elektrické energie kombinován s atmosférickými plyny (standardní koronový výboj), aby se vytvořila reaktivní plazma. Druhá skupina ošetření zahrnuje vakuové plazmové ošetření, při kterém se používá elektrický nebo radiofrekvenční zdroj energie v kombinaci s vakuovou komorou a tlakovým plynem obsahujícím kyslík nebo dusík/kyslík, čímž vzniká reaktivní plazma. Povrchová úprava CellBIND® je jedinečný proces, který zapojuje vysokoenergetický mikrovlnný zdroj, vakuovou komoru a směs plynů, které vytváří vysoce reaktivní plazmu, která modifikuje chemickou povahu polystyrenu.

A. Neupravený polystyrenový řetezec

B. Povrch Corning CellBIND, ošetřením byl navýšen počet funkčních skupin obsahujících kyslík.

Ošetření čistého polystyrenu s vysoce reaktivní Corning CellBIND surface plazmou snižuje počet aromatických skupin a navyšuje počet funkčních skupin obsahujících kyslík.

Na rozdíl od biologických povlaků nevyžaduje Corning CellBIND speciální manipulaci ani skladování. Vzhledem k tomu, že je polymer ošetřen, nikoli potažen, je povrch konzistentnější a stabilnější.

• rychle adaptuje buňky podmínkám bez séra nebo smalým množstvím séra, a tím může eliminovat nutnost použití únavných, časově náročných, drahých a málo stabilních biologických povrchů
• poskytuje rovnoměrnější adhezi buněk, dokonce u buněčných linií, které těžko adherují (zejména transfekovaných buněk)
• snižuje předčasné oddělení buněk od konfluentních kultur, zejména ve válcových lahvích a při buněčných testech
• zvyšuje přežití buněk po kryoprezervaci
• umožňuje lepší obnovu izolátů primárních buněk
• umožňuje růst buněk a produkci bílkovin vpodmínkách s malým množstvím séra
• umožňuje běžnou manipulaci/automatizaci

Povrch Corning CellBIND je k dispozici pro lahve, vícečetné jamkové destičky, Corning CellSTACK® kultivační komory, válcové lahve, 96- a 384-jamkové mikrotitrační destičky a Petriho misky.

Doporučení pro disociace buněk

Inokulace a sklizeň kultury by se měla provádět běžnými způsoby. K odstranění buněk z povrchu CellBIND byly úspěšně použity enzymatické i neenzymatické disociační roztoky. Mezi ně patří: trypsin-EDTA, Accutase®, Versene®, Dispase® a citric saline. Některá disociační činidla, jako je například Dispase nebo Versene, by měly být odstraněny odstředěním před opětovným vysetím buněk.

Zvýšená adheze LNCaP buněk k povrchu Corning® CellBIND®

Vlevo: Zotavení a růst adherentních buněk LNCaP 24 hodin po rozmrazení. Průměrná data získaná z 3 nezávislých experimentů. 

Vpravo: Množství buněk po 7 dnech růstu. Průměrná data získaná z 3 nezávislých experimentů.

Tissue Culture Treated (TCT) – Standardní polystyren ošetřený pro tkáňové kultury

Standardní polystyrenový povrch ošetřený pro tkáňové kultury – klasický a nejpoužívanější povrch pro pěstování buněčných kultur.

Aplikace:

pro běžné kultivace

Způsob úpravy:

Standardní kultivační nádoby se povrchově modifikují buď pomocí koronového výboje (baňky, misky, mikrodestičky), nebo pomocí plynové plazmy (válcové láhve a kultivační zkumavky). Tyto procesy vytváří vysoce energetické kyslíkové ionty, které se integrují do polystyrenového řetězce (obr. 1), takže se povrch stává hydrofilním a záporně nabitým, pokud je umístěn v médiu.

Corning nabízí standardní povrch ošetřený pro tkáňové kultury na lahvích, miskách, vícejamkových destičkách, kultivačních komorách CellSTACK, válcových lahvích a kultivačních falkonách.

Polystyren potažený poly–D–lysinem

Aplikace:

• HEK-293
• NIH3T3
• L929
• fibroblasty myší 3T3
• PC12
• Kuřecí chondrocyty
• Buněčné buňky hypofýzy
• Buněčné buňky vaječníků
• Transgenní myši Q5B a Y8
• Kortikální neurony
• DRG (dorzální kořenové ganglie)
• Neokortické buňky
• Neurony míchy
• Hipokampální neurony
• Cerebelární granulární buňky
• Nádorové buňky GH3 hypofýzy
• SF 21 hmyzí buňky
• Myší buňky GT1-7

Způsob úpravy:

Corning Poly-D-Lysine (PDL) microtitrační destičky jsou potaženy PDL (rozmezí molekulové hmotnosti 70 až 150 kDa). PDL poskytuje povrchu pozitivní náboj pro lepší uchycení buněk.

Výhody:

• zlepšuje diferenciaci primárních neuronů, gliových buněk, neuroblastomů
• zlepšuje adhezi transfekovaných buněčných linií včetně HEK-293
• pomáhá buňkám zůstat adherované během testu

Corning nabízí tento povrch u 96- a 384-jamkových mikrotitračních destiček.

Povrchy zabraňující adhezi

Corning Ultra-Low Attachment – polystyren s povrchem s nízkou přilnavostí

Tento povrch je vhodný pro:

• udržování buněk vsuspenzním stavu
• studium tkáňově specifických funkcí některých rakovinných buněk (tj. buněk rakoviny prsu MCF7)
• zabránění adhezí iniciované diferenciací kmenových buněk
• zabránění adhezi a aktivaci makrofágů a neutrofilů
• selektivní kultivaci nádorových nebo virových transformovaných buněk jako nepřipevněných kolonií (náhrada měkkých agarových testů)
• pěstování primárních kultur nádoru nebo dospělých kmenových buněk jako nepřipravených sféroidů
• zabraňuje buňkám závislým na ukotvení, jako jsou fibroblasty, v adhezi a dělení
• Při používání tohoto povrchu není nutné využívat žádné speciální postupy
• snížení adhezivity až o 99,8%

Povrch Ultra-Low Attachment je kovalentně vázaná hydrogelová vrstva, která je hydrofilní a neutrálně nabitá. Vzhledem k tomu, že se proteiny a jiné biomolekuly pasivně adsorbují na polystyrenové povrchy buď hydrofobními, nebo iontovými interakcemi, tento povrch hydrogelu přirozeně inhibuje nespecifickou imobilizaci těmito silami, a tím inhibuje následnou adhezi buněk. Tento povrch je velmi stabilní, necytotoxický, biologicky inertní a nerozložitelný.

Neošetřený polystyren (Untreated)

Aplikace:

Corning nabízí neošetřené nádoby z polystyrenu a mikrodestičky pro pěstování buněk ve stacionární suspenzi nebo v jiných aplikacích, kde je žádoucí snížená vazba buněk. Tyto neošetřené nádoby jsou sterilizovány nízkými dávkami záření gama, což mírně zvyšuje smáčivost povrchu. Protože některé z transformovaných buněčných linií (např. CHO-K1) a makrofágy se na těchto hydrofobních površích adherují a rostou, nabízí Corning také povrch Ultra-Low Attachment (polystyren s nízkou přilnavostí).

Způsob úpravy:

Nemodifikované polystyrenové povrchy jsou hydrofobní a pouze váží buňky a biomolekuly pasivními hydrofobními interakcemi.

Speciální povrchy

Corning® Synthemax® II-SC

Aplikace:

Substrát Synthemax umožňuje škálovatelnou, vícestupňovou expanzi pluripotentních kmenových buněk v médiích bez séra, jako je mTeSR®, po diferenciaci na řadu buněčných typů, včetně retinálních pigmentových epiteliálních buněk a kardiomyocytů, stejně jako šíření různých typů progenitorových buněk.

Corning Synthemax self-coating substrát je unikátní, animal-free, syntetický peptid na bázi vitronektinu, který obsahuje motiv RGD a doprovodných sekvencí. Jedná se o práškový peptidový kopolymer, který se snadno rozpouští ve vodě. Používá se jako povrchový povlak podporující buněčnou adhezi pro různé linie kmenových buněk.

Benefity:

• snadno rozpustný ve vodě – ready to use
• může být potažen na libovolný formát kultivačního plastiku, což poskytuje koncovým uživatelům další flexibilitu

Corning Osteo Assay

Jedinečná trojrozměrná struktura, která napodobuje povrch kostí in vivo, pro in vitro testování.

Aplikace:

• buněčný růst a diferenciace prekurzorových buněk osteoklastů nebo osteoblastů
• přímé odečtení funkce osteoklastů a osteoblastových buněk a diferenciačních testů, jako je barvení TRAP (fosforečnan kyseliny tartarové), resorpce ruptur a tvorba kostních uzlin
• cílový screening léčiv na aktivitu kostních buněk
• zobrazování vreálném čase pro vysokoobsahovou analýzu
• kvantitativní stanovení enzymatické aktivity vzorkováním supernatantu buněčné kultury

Tento anorganický povrch Corning Osteo Assay je anorganický povlak krystalického fosforečnanu vápenatého na polystyrenové desce navržený tak, aby napodoboval kostní prostředí in vivo. Povrch je určen k usnadnění řady testů na kostní buňce, včetně imunofluorescenčního barvení, barvení TRAP a zkoušek povrchové resorpce pro osteoklasty. Povrch je k dispozici ve sterilním balení vícejamkových destiček, 1 x 8 Corning Stripwell^TM a je stabilní při pokojové teplotě.

Tento povrch také nabízí konzistentní a definovanou alternativu k přípravě dentinových nebo kostních řezů, což snižuje variabilitu ve vašem testovacím systému a vede ke konzistentnějšímu odečtu testu.

K dispozici je v následujících formátech:

3987: 24-jamková destička s Osteo Assay povrchem, sterilní polystyren s vlastním coatingem

3989: 1×8 Stripwell^TM mikrotitrační destička s Osteo Assay povrchem, 12 polystyrenových stripů na platformě, s víčkem, sterilní

Pro více informací o površích Corning si stáhněte brožuru výrobce

(Převzato ze zahraničního zdroje, redakčně upraveno.)