Jak předejít zničení tkání a plýtvání činidly na podložních sklíčkách - tipy od Vector Laboratories

 

U vzorků tkání chcete vždy dosáhnout optimálních podmínek. Strávíte spoustu úmorných hodin ve snaze zajistit ideální podmínky, které vám umožní vzorek zachovat i po odběru a krájení. Pokud zvolíte zalití do parafínu, fixujete vzorek formalínem, provedete jeho dehydrataci v několika alkoholech, vyčistíte ho xylenem a nakonec tkáň zalijete do parafínu. Pokud usoudíte, že vašim potřebám lépe vyhovuje kryogenní konzervace, fixujete vzorek, umístíte ho v bloku do zalévací hmoty OCT a nakonec jej zmrazíte v chlazeném tekutém dusíku, isopentanu nebo suchém ledu. V každém případě máte po získání tkáňového bloku vzorek, ze kterého je třeba vytvořit řezy pro další činnosti, jako je imunohistochemické (IHC) nebo imunofluorescenční (IF) barvení. A po veškeré práci, kterou jste si se svým cenným vzorkem dali, o něj rozhodně při krájení či barvení nechcete přijít. Naší snahou je pomoci vám zachovat co nejlepší zabarvené vzorky na sklíčkách. Níže v článku najdete příslušné tipy, a pokud budete potřebovat pomoc s jinými kroky týkajícími se přípravy vzorků, podívejte se do průvodce přípravou barvených vzorků (Staining Sample Prep Guide) od společnosti Vector Laboratories.

 

 

Ze svých tkáňových řezů chcete vytěžit maximum, ať už v podobě krásných zobrazení nebo kvantifikace dat. Pro získání co nejlepších výsledků je základem zajistit, aby tkáňové řezy zůstaly přilnuté k podkladovému sklíčku. Pokud se rozhodnete použít tkáň zalitou do parafínu, pak je třeba nechat řezy po nakrájení schnout na vzduchu při pokojové teplotě po dobu přibližně 24 hodin nebo v troubě při teplotě 50–60° C po dobu jedné hodiny. Důležité je při sušení v troubě tkáň pečlivě sledovat, neboť příliš dlouhé sušení sklíček při vysokých teplotách může vést ke snížení imunogenicity (1). Některé tkáně je také vhodné nahřívat po dobu 30–60 minut při 50 °C na vyhřívací desce, aby se zabránilo případnému odchlípení vzorku od sklíčka.

Trvalému přilnutí tkáně ke sklíčku po celou dobu procesu může napomoci také použití chemických adhezních činidel, jako je např. VECTABOND® Reagent, které fugnují i v extrémních podmínkách (např. při in situ hybridizaci nebo při odmaskování antigenu při vysoké teplotě). Na přípravku VECTABOND je skvělé, že ho lze použít ke zvýšení adheze k podkladovým i krycím sklíčkům u řezů zalitých v parafínu i zmrazených i u buněčných preparátů. VECTABOND působí tak, že chemickou modifikací vytvoří na povrchu sklíčka pozitivní náboj, který způsobí vysokou přilnavost povrchu. Použití sklíček ošetřených přípravkem VECTABOND je snadné a rychlé. Postupujte následovně:

 

1. U tkání zalitých v parafínu naneste na sklíčka ošetřená přípravkem VECTABOND řezy ve vypínací vodní lázni o teplotě 45° C.
2. Řezy důkladně na vzduchu vysušte.
3. Řezy po dobu 30 minut nahřívejte při teplotě 56° C, aby pevně držely. Většina tkáňových řezů za těchto podmínek přilne velmi dobře. V případě potíží s přilnutím řezů lze adhezi zvýšit zahříváním řezů při teplotě 56° C po dobu až 24 hodin nebo při teplotě 75° C po dobu jedné hodiny. U imunohistochemických aplikací se nedoporučuje používat teploty vyšší než 60° C, neboť může dojít ke ztrátě antigenů.
4. Sklíčka skladujte v boxu při pokojové teplotě. V případě potřeby proveďte deparafinaci a vzorky na sklíčkách zpracujte jako obvykle.

 

U zmrazených tkání řezy nechte před fixací a uložením uschnout na sklíčkách ošetřených přípravkem VECTABOND. Poté je můžete zpracovat jako obvykle.

 

 

Po dokončení krájení a preparace vzorků může být dalším krokem IHC/IF barvení. V takovém případě je zapotřebí zajistit rovnoměrné zabarvení řezů. Vaším zájmem je nejen dosáhnout standardní míry penetrace vzorku činidlem, ale také neplýtvat činidlem. Řešením je nanesení hydrofobní bariéry okolo řezů. Vytvoření této bariéry okolo každého řezu vám umožní použít různá činidla na různé řezy na stejném sklíčku a zároveň omezit množství činidla potřebné k pokrytí řezů. Další výhodou je flexibilita a nižší náklady na vaše experimenty. Tradiční metody jsou komplikované a časově náročné, ale pomocí pera ImmEdge® Hydrophobic Barrier PAP Pen vytvoříte hydrofobní bariéru mnohem snadněji. Zůstává stabilní při použití s pufry s čisticím prostředkem i bez něj (Tween 20, Triton X-100 apod.), je kompatibilní s detekčními systémy na bázi enzymů i fluorescence a je rozpustný ve všech běžně používaných čiřidlech. Použití pera ImmEdge PAP Pen je hračka. Postupujte následovně:

1. Pero před použitím důkladně protřepejte.
2. Sejměte z pera kryt a pero postavte na pevný povrch hrotem vzhůru. Prstem v rukavici stlačte hrot, abyste z pera odstranili vzduch.
3. Opřete hrot pera na podkladové sklíčko a několikrát hrotem proti sklíčku zatlačte, aby důkladně nasákl. Dbejte, abyste do hrotu nenasáli nadměrné množství tekutiny, neboť by se pak nadbytečné činidlo rozlilo po sklíčku.
4. Obtáhněte linku okolo každého vzorku na podkladovém sklíčku.
5. Nechejte činidlo na sklíčku dvě minuty zaschnout a poté sklíčko ponořte do vodného roztoku.

Ještě stále nejste přesvědčeni, že použití pera ImmEdge PAP Pen je jednoduché? Ve videu na konci originálního článku si prohlédněte, jak na to.

 

 

Nyní máte vše připraveno k barvení vzorků, aniž byste se museli obávat, že si řezy zničíte nebo budete plýtvat činidly na tkáňové řezy. Díky těmto tipům získáte dokonalé mikroskopické záběry a pomohou vám také při sběru dat. Další informace najdete na stránce Vectoru se zdroji k imunohistochemii a sledujte také další tipy a triky na blogu SpeakEasy Science Blog.

 

 

 

 

1. Engel KB, et al. 2011. Effects of Preanalytical Variables on the Detection of Proteins by Immunohistochemistry in Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue. Archives of Pathology & Laboratory Medicine.