Proč je horký start tak žhavé téma?

 

Představte si, že si za horkého letního dne připravujete vzorky na PCR. Už jste si smíchali všechny potřebné komponenty, teď už jen vložit vzorky do PCR přístroje. Najednou přijde kolega s tím, že s vámi potřebuje na pár minut probrat neodkladnou záležitost. Jako obvykle je z pár minut čtvrthodina. Nakonec se vrátíte ke svým vzorkům a vložíte je do PCR přístroje. O chvíli později, když má dojít na analýzu výsledků, jsou však výsledky z nějakého důvodu zmatené a nedávají smysl. Povzdechnete si, protože jste promrhali krásný letní den bez výsledku. Jak tedy na to, aby se nic takového příště neopakovalo?

 

 

Pojďme si nejprve říct, kde se stala chyba. Za předpokladu, že nedošlo ke kontaminaci a všechny primery i komponenty mixu pro PCR fungovaly, jak mají, zůstává jediným problémem to, že jste své vzorky nechali čtvrt hodiny čekat při pokojové teplotě. Za tu doby se pravděpodobně primery náhodně navázaly na templáty DNA nebo na sebe navzájem a vytvořily z primerů dimery a započaly nespecifickou amplifikaci, protože jim v tom nic nebránilo. Ve výsledku jste dosáhli nižšího výtěžku a navíc nespecifických výsledků, protože účinnost PCR se částečně vyplýtvala na amplifikaci nepotřebných segmentů [1].

 

 

Jednoduchou odpovědí na otázku, jak tomu předejít, je použití techniky PCR s horkým startem. Při uplatnění této techniky vás nemusí trápit, pokud necháte své vzorky během debaty s kolegou na stole, ani se nemusíte obávat, že než se dostanete k posledním vzorkům, ty první už budou znehodnocené. Ústřední myšlenkou techniky horkého startu je to, že reakce potřebuje ke svému spuštění vysokou teplotu [1][2]. Při přípravě reakce nedojde k žádné nespecifické amplifikaci, protože speciálně modifikovaná DNA polymeráza nezačne reagovat, dokud se v PCR přístroji nezahřeje na 95° C [1][2]. Při použití techniky PCR s horkým startem tak nejen můžete své vzorky v klidu připravovat při pokojové teplotě, ale dosáhnete také vyššího výtěžku o lepší specificitě a citlivosti [1][2].

 

 

• Podívejme se nejprve na horký start zprostředkovaný protilátkami. Na aktivní místo Taq DNA polymerázy se naváže monoklonální protilátka a zabrání tak katalýze [2][3]. Zvýšením teploty dojde k denaturaci protilátky a aktivní místo se tak uvolní. Výhodou je rychlost procesu denaturace protilátky (trvá to 1–3 minuty) a skutečnost, že protilátka nijak polymerázu nemění [2]. Nevýhodou je riziko, že při detekování cílové savčí DNA může dojít ke kontaminaci reakce protilátkou, neboť k produkci protilátek se většinou používají hybridomové buňky savčího původu [4]. Navíc se protilátky produkují převážně in vivo s využitím zvířat (králíků, myší, velbloudovitých), což vyžaduje dodržování přísných pravidel pohody zvířat a nastoluje etické otázky a zároveň zvyšuje celkové výrobní náklady na protilátkami modifikované DNA polymerázy pro horký start.

 

• K chemicky modifikované Taq polymeráze je připojena malá organická sloučenina, která zabrání její aktivitě. Výhodou je absence rizika kontaminace a skutečnost, že chemické inhibitory jsou obecně stabilnější než protilátky, které mohou časem degradovat. Chemické inhibitory navíc vykazují konzistentnější funkčnost, proto obecně vyžadují méně optimalizace než například metody na bázi protilátek. U chemicky modifikované Taq polymerázy zůstává po prvotní aktivaci část polymerázy inhibovaná. V dalších cyklech se aktivují další enzymatické molekuly a reakce se tak zesiluje. Chemicky zprostředkovaný horký start je navíc obecně méně nákladný než metody na bázi protilátek, protože chemická syntéza blokovacího činidla prováděná ve velkém objemu je výrazně levnější než produkce protilátek proti Taq in vivo. Nevýhodou tohoto řešení je skutečnost, že eliminace blokující složky může trvat déle než deset minut a za tu dobu může dojít k tepelnému poškození DNA, kterou zkoumáte. Proto tato metoda není vhodná pro dlouhé cílové sekvence. Může se také stát, že se organickou složku nepodaří dokonale odstranit a nebude možno využít plnou kapacitu polymerázy [2]. Výrobci proto při výrobě chemicky modifikovaných enzymů pro horký start uplatňují velice důkladně nastavené protokoly chemického ošetření, aby dosáhli maximální disponibility aktivního enzymu. Pro dosažení nejlepších výsledků v daném testu se proto doporučuje nejen dodržovat pokyny výrobce, ale také vyzkoušet různé enzymy, které se na trhu nabízejí, abyste našli ten, který nejlépe vyhovuje vašim potřebám.

 

• Horký start s využitím oligonukleotidů (aptamerů) využívá oligonukletidy k zablokování Taq polymerázy do doby, než dojde k jejímu uvolnění zvýšenou teplotou. V principu tato metoda funguje stejně jako horký start zprostředkovaný protilátkami. Její výhodou však je, že oligonukleotidy nejsou tak silné jako malé organické sloučeniny u chemického horkého startu, takže k aktivaci enzymu postačuje přibližně 30 sekund (někdy se používá delší inkubační čas, který umožní denaturaci i delších cílových molekul DNA). Používání oligonukleotidů je rovněž etičtější než používání protilátek. Nevýhodou je poměrně slabá vazba oligonukleotidů na enzym, a pokud nejsou podmínky optimální, může tudíž dojít k určité nespecifické amplifikaci [2]. To může být omezením pro použití horkého startu s oligonukleotidy například u jednokrokové RT-qPCR reakce.

 

• Zřejmě nejneobvyklejší technikou je horký start s použitím voskových korálků. Taq polymeráza je uzavřena uvnitř voskových kuliček. Polymerázu lze použít k reakci, jakmile se voskový obal okolo rozpustí. Výhodou je opět to, že proces aktivace polymerázy netrvá dlouho. Nevýhodou je, že při použití vosku vzniká nepořádek, vosk není rozpustný ve vodě a odebrání amplifikované DNA může být obtížnější [2].

 

Většina mixů Solis BioDyne pro PCR a qPCR pro větší pohodlí již obsahuje činidla nezbytná pro horký start. Metody s chemicky či nukleotidy zprostředkovaným horkým startem se používají k tomu, aby enzymy po dobu přípravy reakce zůstaly neaktivní. Technologie Stability TAG navíc všem našim enzymům i master mixům zajišťuje vylepšenou stabilitu při pokojové teplotě bez ztráty aktivity až po dobu jednoho měsíce, takže můžete vzorky bez obav připravovat i bez ledu. Určitě si také prohlédněte produkty z řady SolisFAST®, které jsou nejen termostabilní, ale navíc také tak rychlé, že můžete dokonalých výsledků dosáhnout opakovaně a ještě si stihnete užít léta.