Stejně jako u jakéhokoliv jiného návrhu experimentů je i při zahájení nového projektu imunohistochemie (IHC) potřeba vzít v úvahu mnoho faktorů. Abychom jmenovali alespoň některé, jedná se například o druh tkáně, kterou budete barvit, zda bude fixována nebo zmrazena, systém označování / detekce, vhodné kontroly barvení a způsob, jakým budete svá data analyzovat.
Jedním z vůbec nejdůležitějších faktorů, které je při plánování IHC experimentu nutné zvážit, je volba primární protilátky. Správný výběr je v tomto kroku zásadní pro vysokou specificitu a minimální zbarvení mimo cílovou strukturu a zvyšuje vaše šance na získání konzistentně spolehlivého signálu, který poskytuje platné biologické informace o vašem vzorku. Abychom tento úkol zjednodušili, představujeme průvodce výběrem primární protilátky pro nový IHC projekt pro začátečníky.
Neobjevujte znovu Ameriku – přejděte na známé dodavatele protilátek
V mnoha případech může váš kolega nebo spolupracovník navrhnout využití jeho dodavatele protilátek. Je však dobré si projít nabídku jednotlivých dodavatelů a hledat protilátky proti vašemu cílovému proteinu. Zkontrolujte všechny příslušné datové listy, zda obsahují údaje o ověření, včetně ukázkových obrazů barvení – byla protilátka validována dodavatelem pro vámi zvolenou aplikaci a typ vzorku, např. IHC na zmrzlé mozkové tkáni myší?
Jakou protilátku používají všichni ostatní?
Pokud jste zkontrolovali všechny dodavatele protilátek, které znáte a nedostali jste se dál, je čas nahlédnout do literatury. Mnoho dodavatelů zahrnuje seznamy citací pro každou ze svých protilátek nezávisle na aplikaci, což vám umožňuje identifikovat protilátky, které se nejčastěji používají pro váš cílový protein. Pokud ne, můžete si literaturu vyhledat sami. Tento přístup vám může pomoci identifikovat další dodavatele, stejně jako výzkumníky, kteří použili danou protilátku v IHC, i když dodavatel neuvádí IHC jako testovanou aplikaci.
Pokud vám poskytují dostatek informací, nezapomeňte citace kriticky prostudovat, abyste mohli dále pokračovat v laboratorní práci. Například, zatímco publikace často uvádějí katalogová čísla použitých protilátek, zřídkakdy uvádějí použitá ředění protilátek nebo podmínky barvení. Pokud k tomu dojde, kontaktujte autory a požádejte o další informace.
Jak byla protilátka validována?
Ať už identifikujete kandidátní protilátku prostřednictvím dodavatele nebo literatury, jakmile se dostanete k validaci, je nutné ji posoudit kritickým okem.
Pokud byla primární protilátka validována proti nadměrně exprimované formě cílového proteinu s dobrými výsledky barvení v IHC, nezaručuje to dobré výsledky při pokusu o barvení nativního proteinu. Totéž platí pro protilátky, které jsou validovány v tkáních, které vysoce exprimují váš cílový protein – tato úroveň ověření nemusí stačit, pokud se zaměřujete na typ tkáně s nízkou expresí nebo nemocnou tkáň, kde je úroveň exprese cílového proteinu snížena.
Někteří dodavatelé uvádí, že protilátka byla pro danou aplikaci validována, aniž by uvedli údaje nebo zveřejnili podrobnosti o tom, jak byla validace provedena. Pokud vás ověřovací údaje nepřesvědčily, nebojte se kontaktovat dodavatele a zeptat se. Mohou mít další informace kromě toho, co je uvedeno v datovém listu. A pokud budete mít štěstí, mohou vám poskytnout nízkoobjemovou velikost testu za nízkou cenu nebo dokonce bezplatný vzorek, abyste si mohli protilátku otestovat sami.
Monoklonální nebo polyklonální?
V této fázi jste možná našli protilátku k testování, nebo máte minimálně z čeho vybírat. Tato část pojednává o tom, jak si můžete vybrat mezi monoklonální nebo polyklonální protilátkou, pokud máte obě možnosti.
Díky jejich odolnosti vůči změnám v podmínkách barvení, např. pH, složení pufru, typu tkáně, poskytují polyklonální protilátky často lepší výsledky barvení v IHC než monoklonální protilátka namířená proti jednomu konkrétnímu antigenu. Mezi další výhody polyklonálních protilátek pro IHC patří:
- Rozpoznávají více epitopů na cílovém antigenu, čímž se zvyšuje jejich celková afinita.
- Rozpoznání více epitopů zvyšuje citlivost, což může být zvláště užitečné pro detekci slabě exprimovaných cílových proteinů.
- Mohou být lepší v detekci nativních proteinů, protože rozpoznávají více epitopů. Pokud tedy preanalytické ošetření, pH nebo teplota způsobily, že některé epitopy byly skryty nebo zničeny, budou stále k dispozici další epitopy pro navázání polyklonálních protilátek.
Než se však vrhnete do hromadného objednávání polyklonálních primárních protilátek pro IHC, měli byste mít na paměti, že jejich schopnost rozpoznat více epitopů může být také nevýhodou, zvláště pokud to zvyšuje jejich pravděpodobnost zachycení jiných než cílových antigenů. Pokud se například pokoušíte obarvit protein, který patří do rodiny s velmi podobnými členy, možná budete chtít zvážit použití monoklonální primární protilátky, protože jejich specificita vůči jedinému epitopu na vašem cílovém proteinu výrazně sníží riziko nespecifických vazeb. Je však velmi důležité přesto zajistit, aby i monoklonální protilátka byla validována pro zkříženou reaktivitu s ostatními členy rodiny proteinů. Pokud se touto cestou vydáte, mějte na paměti, že monoklonální protilátky jsou často velmi citlivé na i nepatrné změny testovacích podmínek, takže pro konzistentní výsledky barvení budete muset vyvinout velmi standardizované protokoly.
Našli jste svou protilátku. Co teď?
Možná jste našli vynikajícího kandidáta na primární protilátku, ale mnohdy nevíte, jestli je to ten pravý, dokud nepůjdete do laboratoře a nevyzkoušíte ho. Optimální podmínky barvení pro jakoukoli primární protilátku budou záviset na daném experimentu a budou proto vyžadovat určitou míru optimalizace pro vysoce kvalitní barvení. Jako obecné pravidlo doporučujeme začít s doporučeními dodavatele, které se týkají podmínek barvení, např. pracovního ředění, podmínek preanalytiky, inkubační teploty a blokačních a promývacích pufrů.
Pokud stále marně hledáte primární protilátku nebo chcete poradit ohledně optimalizace protilátek nebo jakéhokoli jiného aspektu IHC, neváhejte své dodavatele kontaktovat.
A pokud Vás zajímá, jak vybrat sekundární protilátku, přečtěte se tento článek.
(Převzato od společnosti Nordic BioSite, redakčně upraveno.)