Vítejte zpět v našem průvodci imunohistochemií (IHC) pro začátečníky. V tomto příspěvku navážeme na náš předchozí článek o výběru primární protilátky a přiblížíme vám nejdůležitější aspekty výběru sekundární protilátky.
Shoda hostitelského organismu a isotypu primární protilátky
Sekundární protilátka by měla vždy cílit na druh organismu, ve kterém byla připravena primární protilátka. Pokud například používáte primární protilátku připravenou v králíkovi, sekundární protilátka musí být mířena proti králíkovi (anti-rabbit). Měli byste se také ujistit, že isotyp detekovaný sekundární protilátkou odpovídá isotypu primární protilátky.
Kompletní imunoglobuliny nebo fragmenty Fab/F(ab')2?
Zvažte, zda chcete použít kompletní imunoglobulin nebo fragmenty protilátek. Fragmenty Fab a F(ab')2 jsou regiony protilátky, které vážou antigen a které zůstanou zachovány po úplném nebo částečném odstranění regionu Fc. Enzymatickým štěpením protilátek papainem nebo pepsinem vznikají fragmenty Fab, které obsahují buď jedno vazebné místo a žádný region Fc (monovalentní protilátky), nebo fragmenty F(ab')2, které mají dvě vazebná místa spojená disulfidovou vazbou (divalentní protilátky).
Fragmenty Fab se při IHC často používají k blokování nespecifické vazby konjugátů na endogenní imunoglobuliny v následných krocích barvení, zatímco fragmenty F(ab')2 se často značí a používají jako konjugáty při barvení tkání nebo tělních tekutin s vysokým množstvím receptorů Fc, jako jsou lymfatické uzliny, brzlík a krev. Kromě toho jsou fragmenty protilátek malé, a pronikají proto do tkání snadněji než celé imunoglobuliny, takže jsou vhodnou volbou při experimentech vyžadujících několikanásobné IHC barvení.
Minimalizace pozadí použitím preabsorbovaných protilátek
Při hledání protilátek pro IHC na internetu často narazíte na preabsorbované sekundární protilátky. Preabsorpce je další purifikační krok, při němž se roztok protilátky absorbuje, tj. vystaví se imobilizovanému zvířecímu nebo lidskému séru, aby se ze směsi odstranily nespecifické protilátky. Tím se zvyšuje specifičnost absorbovaných protilátek, čímž se snižuje riziko nespecifického zabarvení pozadí.
Ačkoli má absorpce své zřejmé výhody, absorbované protilátky mají často výrazně sníženou schopnost rozpoznání epitopů a mohou také velmi slabě rozpoznávat určité podtřídy IgG, zejména podtřídy, které se nejvíce podobají druhu, proti němuž byly absorbovány. Proto byste měli absorbované protilátky používat pouze v případě, že je to nezbytně nutné. Můžete například zvážit použití antihumánního IgG, který byl absorbován proti myšímu IgG, pokud plánujete detekovat lidskou primární protilátku v myší tkáni obsahující myší imunoglobulin.
Úroveň purifikace
Při IHC se běžně používají afinitně purifikované protilátky, protože vytvářejí minimální nespecifickou vazbu. V situacích vyžadujících protilátky o vysoké afinitě, např. při nedostatku cílových antigenů, však může být užitečné použití IgG frakcí.
Značení / konjugované molekuly
Obecně lze říci, že sekundární protilátky se značí buď enzymy (např. alkalickou fosfatázou nebo křenovou peroxidázou - HRP), fluorochromem (např. FITC), nebo biotinem. Konjugáty s alkalickou fosfatázou se vyznačují vysokou citlivostí, zejména v kolorimetrických detekčních sestavách. Peroxidáza je stabilní enzym, který poskytuje signály s vysokou intenzitou v krátkém časovém období a bývá levnější než jiné enzymové konjugáty. Fluorochromem značené nebo fluorescenční protilátky se obvykle používají v protokolech vyžadujících více kol barvení. Detekční formáty využívající protilátky značené biotinem těží ze silné afinity mezi biotinem a jeho vazebnými partnery, např. avidinem a streptavidinem. Protilátky značené biotinem se tak vyznačují vyšší citlivostí než výše uvedené typy konjugátů, protože komplexy biotinu a strept(avidinu) jsou velmi stabilní a odolné vůči kolísajícím podmínkám testu a každá molekula biotinu může vázat více molekul strept(avidinu), čímž se zesiluje detekční signál.
Pro dosažení ještě vyšší citlivosti, například při detekci proteinů s velmi nízkým výskytem, jsou vhodnou volbou sekundární protilátky v HRP-polymeru. Tyto protilátky využívají technologii mikropolymerů k vytvoření menších detekčních komplexů, které snadněji pronikají do tkání a dosahují tak vyšší citlivosti. Sekundární protilátky v HRP-polymeru jsou kromě toho schopny vázat větší množství křenové peroxidázy než sekundární protilátky konjugované se standardní HRP, což vede k vyšší intenzitě signálu.